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Aug 07, 2023

Ein möglicher Transporter, der es symbiotischen Dinoflagellaten ermöglicht, ihre Korallenwirte zu ernähren

ISME Communications Band 3,

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 7 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die symbiotische Partnerschaft zwischen Korallen und Dinoflagellatenalgen ist für Korallenriffe von entscheidender Bedeutung. Korallen bieten ihren Algensymbionten Schutz, Kohlendioxid und Stickstoff. Im Gegenzug versorgen die symbiotischen Algen ihre tierischen Wirte mit festem Kohlenstoff in Form von Glukose. Aber wie Glukose vom Algensymbionten auf den tierischen Wirt übertragen wird, ist unbekannt. Wir gingen davon aus, dass ein in der Dinoflagellaten-Zellmembran ansässiger Transporter den Transfer von Glukose nach außen in das umgebende Wirtstiergewebe erleichtern würde. Wir haben einen möglichen Transporter im Nesseltier-Symbionten Dinoflagellaten Breviolum minutum identifiziert, der zur allgegenwärtigen Familie der unterstützenden Zucker-Uniporter gehört, die als SWEETs bekannt sind (Zucker werden schließlich exportierte Transporter sein). Frühere Genexpressionsanalysen hatten gezeigt, dass BmSWEET1 im Vergleich zum freilebenden Zustand hochreguliert ist, wenn die Algen symbiotisch in einem Nesseltierwirt leben [1, 2]. Wir verwendeten Immunfluoreszenzmikroskopie, um BmSWEET1 in der Dinoflagellaten-Zellmembran zu lokalisieren. Substratpräferenztests in einem Hefe-Ersatztransportsystem zeigten, dass BmSWEET1 Glukose transportiert. Quantitative Mikroskopie zeigte, dass symbiotische B. minutum-Zellen deutlich mehr BmSWEET1-Protein aufweisen als frei lebende Zellen desselben Stamms, was mit einem Export während der Symbiose, nicht jedoch während der frei lebenden Planktonphase, übereinstimmt. Somit ist BmSWEET1 zur richtigen Zeit am richtigen Ort und verfügt über das richtige Substrat, um als Transporter zu fungieren, mit dem symbiotische Dinoflagellatenalgen ihre tierischen Wirte ernähren, um Korallenriffe mit Strom zu versorgen.

Symbiose ist eine leistungsstarke Evolutionsstrategie, die Fähigkeiten verschiedener Arten kombiniert, um als Konsortium den Herausforderungen der Umweltselektion zu begegnen. Im Fall von Korallenriffen ermöglicht die Partnerschaft ein üppiges Wachstum in nährstoffarmen Gewässern, die sonst nur sehr wenig Biomasse unterstützen würden [3]. Korallenriff-Symbiosen sind bemerkenswert erfolgreich. Obwohl Riffe nur 0,1 % der Meeresumwelt ausmachen, beherbergen sie mehr als 33 % der Meeresvielfalt [4].

Die symbiotischen Algen in Korallen nutzen CO2 und Lichtenergie, um durch Photosynthese Zucker herzustellen. Der Zucker wird an die Koralle verfüttert, und dieser symbiotische „Währungstransfer“ [5] untermauert die Fähigkeit der meisten Korallen, Kalziumkarbonat abzulagern und so ein Riff aufzubauen [3]. Im Gegenzug versorgt der Korallenwirt seine Algensymbionten mit Schutz, CO2 und wertvollem Stickstoff. Die Übertragung von photosynthetisch fixiertem Kohlenstoff vom Symbionten auf den Wirt wurde vor mehr als 60 Jahren von Muscatine und Hand nachgewiesen [6], und Symbionten liefern bis zu 90 % der von einer Koralle verbrauchten Energie [3]. Frühe Arbeiten, bei denen vom Wirt entfernte Symbionten verwendet wurden, zeigten, dass Glycerin der Hauptexport war [7]. Jüngste Studien mit intakten Partnerschaften zeigen jedoch, dass Glukose der Hauptexport ist, und legen nahe, dass die Glycerinfreisetzung durch Symbionten entweder ein Artefakt ist, das durch die Isolierung von ihrem Wirt induziert wird [8,9,10] oder möglicherweise als Osmolyt in die Vakuole des Symbiosoms transportiert wird [ 11]. Somit wissen wir, welche Form von Photosynthese übertragen wird und wie viel Übertragung stattfindet, aber wir wissen im Wesentlichen nichts darüber, wie die Übertragung erfolgt.

Übertragenes Photosynthese muss mindestens zwei Membranen passieren: die Algenzellmembran; und das sogenannte Symbiosom, eine vakuolenartige Membran, die während der phagozytotischen Aufnahme eines Symbionten durch einen Wirt entsteht [12]. Da Glukose membranundurchlässig ist, gibt es wahrscheinlich Transporter in einer oder beiden Membranen, die Glukose nach außen transportieren. Wir gehen davon aus, dass sich mindestens ein Transporter in der Zellmembran des Symbionten befindet und überwiegend im Gastland aktiv ist. Um den bzw. die Transporter zu identifizieren, verglichen wir zuvor die Genexpression in frei lebenden und symbiotischen Zellen von Breviolum minutum [1], einem Dinoflagellaten-Symbionten aus Korallen und Anemonen [13]. Mehrere Transporter zeigten eine erhöhte Expression in Hospite [1], und einer – den wir BmSWEET1 nennen – wird hier weiter charakterisiert.

Exaiptasia diaphana-Seeanemonen des Genotyps AIMS3 [13] wurden in einem begehbaren Raum mit konstanter Temperatur bei einer konstanten Temperatur von 26 °C, einem Licht-Dunkel-Photoperiodenzyklus von 12:12 Stunden und 15 μmol Photonen m−2 s−1 gehalten ( Die GBR-Anemonen sind lichtempfindlich und bevorzugen wenig Licht [13] sowie eine konstante Luftzufuhr. Anemonen wurden in drei Replikaten von 2,4-l-Kunststoffbehältern mit Meerwasser (Rotes Meersalz, Salzgehalt 34 ppt) unter den gleichen Bedingungen gehalten. Anemonen wurden zweimal pro Woche nach Belieben mit frisch geschlüpften Artemia sp. gefüttert. Nauplien (über Nacht unter konstanter Luftzufuhr geschlüpft) und Fadenalgen wurden vor dem wöchentlichen vollständigen Wasserwechsel entfernt.

B. minutum-Zellen wurden aus einer einzelnen genotypisierten E. diaphana-Anemone isoliert und kultiviert [14]. Drei replizierte Subkulturen wurden in Zellkulturflaschen (0,2 μm belüfteter Membrandeckel) mit 0,2 μm gefiltertem Meerwasser (FSW), ergänzt mit 1 x Diagos IMK-Medium (Novachem), erzeugt. Die Kulturen wurden in einer Wachstumskammer (740FHC LED, HiPoint) bei einer konstanten Temperatur von 26 °C, einem Licht-Dunkel-Photoperiodenzyklus von 12:12 Stunden und 60 μmol m−2 s−1 Photonen gehalten. Die Kulturen wurden routinemäßig mittels Lichtmikroskopie überwacht, um ihren Gesundheitszustand zu beurteilen (Zellen sind intakt, vital und bewegliche Zellen sind vorhanden). Die replizierten Subkulturen wurden vor der Proteinextraktion und der Probenahme für Immunfluoreszenz mindestens sechs Monate lang aufbewahrt und aufrechterhalten.

Die Aminosäuresequenz von BmSWEET1 wurde aus dem B. minutum-Transkriptom (GICE01031994) abgeleitet [1]. Die Molekularmasse wurde mit dem ExPASy Compute PI/MW-Tool (https://web.expasy.org/compute_pi/) berechnet. Mutmaßliche Transmembrandomänen wurden mit den Programmen Phobius [15] und HMMTOP [16] vorhergesagt. Eine vorhergesagte Struktur von BmSWEET1 wurde mit ColabFold [17] generiert und mit der Reis-OsSWEET2b-gelösten Struktur [18] mit ChimeraX [19] überlagert.

Antiserum gegen BmSWEET1 wurde unter Verwendung synthetischer antigener Peptide (Mimotope) und der Dienste der Walter and Eliza Hall (WEHI) Antibody Facility (Bundoora, VIC) hergestellt. Anti-BmSWEET1 wurde gegen das mit Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin konjugierte Peptid RKKPDENSPVSPS gezüchtet und zur Immunisierung von zwei verschiedenen Kaninchen in einem 82-tägigen Impf- und Entnahmeplan verwendet, der insgesamt vier Auffrischungen umfasste. IgGs aus den Kaninchenseren wurden mithilfe einer Affinitätssäule (WEHI) gereinigt und die Immunreaktivität (Effizienz und Spezifität) gegen das Antigen wurde durch ELISA (WEHI) und Western Blot (siehe unten) bewertet.

Protein wurde aus B. minutum-Kulturen wie beschrieben [20] mit den folgenden Modifikationen extrahiert. Zellen aus 20 ml Kultur wurden durch 1-minütige Zentrifugation bei 15.000 U/min pelletiert und dann mit FSW gewaschen. Einer zweiten Zentrifugation folgte die Resuspension mit FSW mit 2 % Triton X100 (Sigma). Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt. Das Pellet wurde weiter mit Extraktionspuffer (100 mM Tris, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,4), ergänzt mit Proteaseinhibitor (Roche kompletter EDTA-freier PI-Cocktail), resuspendiert. Die Zellen wurden mit 710–1180 mm großen, säuregewaschenen Glasperlen (Sigma) und einem TissueLyser II (Qiagen) 90 s lang bei 30 Hz homogenisiert. Die Perlen wurden entfernt und das Homogenat 5 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde aufbewahrt und die Proteinkonzentration mithilfe des Qubit-Proteintestkits gemäß den Anweisungen des Herstellers (ThermoFisher) bestimmt.

Eine Proteinprobe von 20–30 μg wurde mit Bolt LDS-Probenpuffer (ThermoFisher) und Bolt Sample Reducing Agent (ThermoFisher) in einem Gesamtvolumen von 40–50 μl gekocht (70 °C, 10 Min.). Die Proteine ​​wurden auf Bolt 4–12 % Bis-Tris Plus Gel (ThermoFisher) aufgetrennt und gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde über Nacht mit 5 % Magermilch in TBS-Puffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,8 mM Tris-Base, pH 7,4) mit 0,05 % Tween20 (TTBS) blockiert. Die Membran wurde 1 Stunde lang mit dem primären Antikörper geblottet, dann dreimal 5 Minuten lang mit TTBS gewaschen und dann mit Amersham ECL-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Bio-Strategy), inkubiert. Es wurden drei weitere 5-minütige Waschvorgänge durchgeführt, bevor die Membran 5 Minuten lang SuperSignal West Pico PLUS-Reagenzien ausgesetzt wurde (ThermoScientific).

Um die Spezifität des Antiserums zu überprüfen, wurde das Serum mit dem Peptidantigen (Molverhältnis 1:1) 1 Stunde lang unter Schütteln bei Raumtemperatur vorinkubiert, bevor wie oben beschrieben ein Western-Blot durchgeführt wurde.

Drei Replikate kultivierter frei lebender und symbiotischer (frisch aus Anemonen [1] isolierter) B. minutum-Zellen wurden entweder mit Anti-BmSWEET1, Präimmunserum oder ohne primären Antikörper auf Immunfluoreszenz markiert, gefolgt von Waschungen und einem sekundären, fluoreszierend markierten Antikörper wie unten.

Zwei ml (~1 × 106 Zellen) aus jedem der drei Replikatkolben wurden zur quantitativen Immunfluoreszenz entnommen [16]. Die Zellen wurden durch 1-minütiges Zentrieren bei 15.000 U/min pelletiert und mit 2 ml FSW gewaschen. Die Zellen wurden durch Inkubation mit 4 % Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences) in phosphatgepuffertem Salzpuffer (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) für 3 Stunden bei 4 °C fixiert. Zur Permeabilisierung wurden die Zellen 10 Minuten lang mit 0,1 % Triton X100 in PBS inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und dreimal mit 0,1 % Tween20 (Bio-Rad) in PBS (PBST) gewaschen. Anschließend wurde die Blockierung unspezifischer Bindung durch 2-stündige Inkubation mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma) in PBST erreicht. Darüber hinaus wurde das Zellpellet mit dem primären Antikörper, verdünnt in 0,1 % BSA in PBST, suspendiert und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach drei Wäschen mit PBST wurden die Zellen mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Alexa Fluor 546 (ThermoScientific) 1:500 in 0,1 % BSA in PBST, für 2 Stunden im Dunkeln suspendiert. Abschließend wurden die Zellen mit DAPI (ThermoScientific) 1:100 in 0,1 % BSA in PBST 10 Minuten lang im Dunkeln inkubiert.

Symbiontenzellen wurden aus 20–30 mittelgroßen Anemonen des Genotyps AIMS3 durch Homogenisierung mit einem Glashomogenisator und mehreren (~10) Drehungen bei 15.000 U/min, 1 Minute und Waschen mit FSW isoliert. Durch dieses Verfahren wurden die Wirtszellen im resultierenden Homogenat minimiert. Der Rest des IFA-Protokolls war das gleiche wie oben für die kultivierten Symbionten beschrieben.

Fünf µl der Probe wurden mit ProLong™ Glass Antifade Mountant (ThermoScientific) auf PTFE-bedruckte Objektträger (SPI-Zubehör) geladen und auf einem inversen konfokalen Nikon A1R-Mikroskop sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit DAPI- und TRITC-Filtern aufgenommen.

Die Quantifizierung der Intensität des Signals wurde durch eine weitere Analyse der Bilder mit der Fidschi-Software (ImageJ) [21] erreicht, die es uns ermöglichte, das BmSWEET1-Signal als Proxy für die Proteinmenge zu vergleichen. Zufällig ausgewählte Zellen (mindestens 100 Zellen) aus jedem der drei Replikate und jeder Behandlung wurden anhand ihrer Form, Größe und Chlorophyll-Autofluoreszenz identifiziert. Anschließend wurde die mittlere Intensität der Färbung um die Zelle herum anhand der Fluoreszenz des sekundären Antikörpers bestimmt. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Zellwanddicke zwischen frei lebenden und symbiotischen Algenzellen beobachtet (Abb. S1), daher gehen wir davon aus, dass der Zugang zu den Markierungsreagenzien gleichwertig ist.

Die statistische Analyse für die quantitative Mikroskopie wurde mit der SPSS-Software (Version 20.0., IBM Corp.) durchgeführt. Die Daten wurden auf Normalität und gleiche Varianzen getestet. Um statistisch signifikante Ergebnisse zu unterscheiden, verwendeten wir die Zwei-Wege-ANOVA-Analyse, gefolgt von einem Post-hoc-Mehrfachvergleichstest (Tukey HSD) (p < 0,05).

Es wurden drei Negativkontrollen für die Immunfluoreszenz durchgeführt. Die erste umfasste die Markierung mit einem Präimmunserum, das kein Signal lieferte (nicht gezeigt). Die zweite Methode war die einstündige Vorinkubation des Serums mit dem Peptidantigen (Molverhältnis 1:1) unter Schütteln bei Raumtemperatur vor der Zugabe des Serums zu den Objektträgern, was zu keinem gelben BmSWEET1-Signal führte (nicht gezeigt). Die dritte Negativkontrolle bestand darin, den primären Antikörper wegzulassen.

Die kodierenden Sequenzen von AtSWEET1 (AT1G21460) und AtSWEET11 (AT3G48740) wurden aus Arabidopsis thaliana-cDNA unter Verwendung der Primer SF46/SF47 bzw. SF52/SF53 (Tabelle S1) amplifiziert. Die cDNA-Sequenz von BmSWEET1 wurde für Saccharomyces cerevisiae codonoptimiert und von Integrated DNA Technologies synthetisiert. Synthetisierte Genfragmente wurden für die PCR mit den Primern SF50/SF51 verwendet. Die PCR-Fragmente wurden in pJet1.2 (Thermo Fisher Scientific) subkloniert und durch Sequenzierung verifiziert. Nach der Verdauung mit PacI und XhoI wurden die Fragmente in den Hefe-Expressionsvektor pDR195 ligiert [22].

Der Hefestamm EBY4000 [hxt1–17D::loxP gal2D::loxP stl1D::loxP agt1D::loxP ydl247wD::loxP yjr160cD::loxP], ein Mutant in mehreren Hexoseimporteuren [23], wurde mit den verschiedenen pDR195-Vektoren transformiert –enthält entweder AtSWEET1, AtSWEET11, BmSWEET1 als Insert oder den pDR195-Vektor ohne Insert, wie beschrieben [24]. Transformanten wurden auf YNB-Medium + \({{{\mathrm{NH}}}}_{4^{+}}\), +His, + Trp, +2 % Mal, - Ura selektiert und durch PCR verifiziert.

Um die Glukoseaufnahmeaktivität zu testen, wurden die verschiedenen Hefestämme über Nacht in YNB-Medium (+ His, + Trp, + 2 % Mal) bei 30 °C und 160 U/min vorkultiviert. Für EBY4000 wurde dem Medium Ura hinzugefügt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (2500 × g, 10 min, Raumtemperatur) geerntet und zweimal mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gewaschen. Die optische Dichte wurde auf OD600 = 3 eingestellt. Die Hefestämme wurden als Reihenverdünnung auf YNB-Mediumplatten mit oder ohne Ura getupft und entweder mit 2 % Mal oder Glc als Kohlenstoffquelle ergänzt. Zusätzlich wurde die Wirkung von 0,2 % 2-Desoxy-D-Glucose getestet. Das Wachstum wurde durch Fotografie nach 3-tägiger Inkubation bei 30 °C oder 5-tägiger Inkubation bei 30 °C mit Fru als Kohlenstoffquelle dokumentiert.

BmSWEET1 (GICE01031994) weist eine hohe Sequenzähnlichkeit mit Mitgliedern einer Transporterfamilie auf, die als SWEETs bekannt ist (Zucker werden schließlich exportierte Transporter sein) (Abb. 1A). SWEETs wurden erstmals in Pflanzen entdeckt [25], wo sie unter anderem den Export von Zucker aus den Blättern für den Transport zu den nicht-photosynthetischen Wurzeln, das Laden von Zucker in Samen, um neuen Pflanzen den Start ins Leben zu ermöglichen, und die Sekretion von Zucker in Blütennektaren zur Anlockung umfassen Bestäuber [25, 26]. Seit ihrer ersten Entdeckung in Pflanzen wurden SWEETs anschließend bei Tieren (27), Pilzen (28), Protisten (28, 29) und Bakterien (28, 29) identifiziert. Eukaryotische SWEETs entstanden offenbar durch die Fusion zweier prokaryotischer Halbtransporter, die als Semi-SWEETs bekannt sind [28]. Die Struktur eukaryotischer SWEETs mit zwei über eine Inversionslinkerhelix verbundenen Dreifachhelixbündeln (dh sieben Transmembrandomänen) [18, 28] steht im Einklang mit der Fusion zweier Semi-SWEET-Gene [18, 28]. SWEETs sind bidirektionale Uniporter, die die Diffusion von Zuckern entlang eines Konzentrationsgradienten erleichtern [25, 30]. In Pflanzen können die Substrate Glucose, Fructose und Saccharose sein [25, 30].

A Ausrichtung von BmSWEET1 mit OsSWEET2b (Reis-SWEET2b), die ein hohes Maß an Sequenzähnlichkeit zeigt (* [Sternchen] zeigt Positionen mit vollständig konserviertem Rest an, [Doppelpunkt] zeigt die Konservierung zwischen Gruppen mit stark ähnlichen Eigenschaften an, und [Punkt] zeigt die Konservierung zwischen Gruppen an von schwach ähnlichen Eigenschaften [19]). Zwei MtN3-Domänen in BmSWEET1 sind durch rosa Balken gekennzeichnet. Vorhergesagte Transmembranhelices in BmSWEET1 werden durch grauen Text angezeigt. Tyrosin 61 (grün) am extrafazialen Tor von OsSWEET2b (17) ist in BmSWEET1 konserviert, ebenso wie drei der vier Proline (rot), die den OsSWEET2b-Substrattunnel (17) auskleiden. Das Asparaginpaar (Kleinbuchstabe n) an der Substratauswahlstelle in OsSWEET2b (17) ist in BmSWEET1 aus dieser Ausrichtung nicht erkennbar. Das zur Herstellung des Anti-BmSWEET1-Serums verwendete Peptid ist durch eine rote Linie gekennzeichnet. B Gelöste Struktur von Reis OsSWEET2b mit sieben Transmembranhelices [18]. C ColabFold sagte die Struktur von BmSWEET1 voraus und zeigte acht Transmembrandomänen. Die ungefähre Position des Peptids, das zur Erzeugung des BmSWEET1-Antiserums verwendet wurde, wird als rote Linie angezeigt. D Überlagerung der Strukturen OsSWEET2b (beige) und BmSWEET1 (blau), die eine umfassende Kolinearität sowie eine zusätzliche N-terminale Transmembrandomäne (rechte Seite) in BmSWEET1 zeigt.

BmSWEET1 weist Primärstrukturmerkmale eines typischen eukaryotischen SWEET auf, nämlich zwei MtN3/Speicheldomänen und sieben vorhergesagte Transmembranhelices [18, 25]; Eine mögliche achte Transmembrandomäne wird in einer N-terminalen Verlängerung von BmSWEET1 vorhergesagt, die nicht mit pflanzlichen SWEETs geteilt wird (Abb. 1A). Die Ausrichtung [31] von BmSWEET1 mit dem Reis-SWEET2b (OzSWEET2b) zeigt ein hohes Maß an Sequenzidentität (Abb. 1A) und konservierte Merkmale wie das Tyrosin am externen Tor [18, 25] und drei von vier Prolinen dieser Linie Der Transportweg [18, 25] ist in BmSWEET1 erkennbar (Abb. 1A). Allerdings ist das Asparaginrestpaar, das die Glucosesubstrat-Erkennungsstelle in OsSWEET2b umgibt [18], in BmSWEET1 nicht erkennbar (Abb. 1A). Wir verwendeten Alpha Fold [17], um eine Struktur von BmSWEET1 vorherzusagen (Abb. 1C) und verglichen die vorhergesagte Struktur des Dinoflagellatenproteins mit der gelösten Struktur für Reis, OsSWEET2b [18] (Abb. 1B). AlphaFold bestätigte die Existenz von acht Transmembrandomänen in BmSWEET1 (Abb. 1C). Die vorhergesagte BmSWEET1-Struktur ist der OsSWEET2b-Struktur [18] sehr ähnlich, wobei sieben Transmembranhelices fast genau überlappen (Abb. 1D). Die zusätzliche (achte) vorhergesagte Transmembran im BmSWEET1-Protein liegt in dieser Ansicht auf der rechten Seite (Abb. 1C) und würde dazu führen, dass der N-Terminus intern liegt, was im Gegensatz zum Reisprotein steht, bei dem der N-Terminus extrazellulär liegt [ 18]. Welche Rolle die zusätzliche (achte) Transmembran in BmSWEET1 spielt und ob BmSWEET1 als Homotrimer wie der Glukose-erleichternde Transporter aus Reis existiert [18], muss noch ermittelt werden. Dennoch ist die Ähnlichkeit der beiden Proteine ​​(Abb. 1D) bemerkenswert, wenn man bedenkt, dass Dinoflagellaten und Pflanzen zuletzt vor etwa 2 Milliarden Jahren einen gemeinsamen Vorfahren hatten [32]. Basierend auf Sequenzanalyse und Strukturmodellierung halten wir es für äußerst wahrscheinlich, dass BmSWEET1 ein bidirektionaler Zucker-Uniporter mit unbestimmten Substratpräferenzen ist.

Fünf weitere SWEET-ähnliche Gene sind auch in den genomischen Ressourcen von B. minutum erkennbar [2] (Tabelle S1). Keiner von ihnen wurde in Hospite hochreguliert [1] und sie werden hier nicht weiter charakterisiert. Wichtig ist, dass wir SWEET-ähnliche Gene auch in anderen symbiotischen Dinoflagellaten fanden, für die genomische Ressourcen verfügbar sind (Tabelle S1).

Laut WoLF PSORT [33] wird BmSWEET1 als Zellmembranprotein vorhergesagt, und unser nächster Schritt bestand darin, das Protein zu lokalisieren. Antiseren gegen ein für BmSWEET1 einzigartiges Peptid (RKKPDENSPVS) (Abb. 1A, C) schmücken eine einzelne Bande mit einer scheinbaren Masse von 54 kDa in Western Blots von SDS-PAGE-getrennten B. minutum-Proteinen (Abb. 2A). Durch die Vorinkubation des Serums mit dem Peptid wurde die Bindung des Serums an diese Bande aufgehoben (Abb. 2B), was zeigt, dass das Serum spezifisch für das BmSWEET1-Peptid ist. Die scheinbare Masse von BmSWEET1 stimmt einigermaßen mit der vorhergesagten Masse (35 kDa) überein, wenn man bedenkt, dass Membranproteine ​​in der SDS-PAGE häufig aberrant wandern [34].

A Das Peptid-Antiserum markiert eine einzelne Bande mit einer Molekularmasse von 56 kDa in kultivierten Zellen. Die B-Markierung wird durch Vorinkubation des Serums mit dem antigenen Peptid aufgehoben. C Zehn kultivierte B. minutum-Zellen, blau markiert mit DAPI. D BmSWEET1-Antiserum in Gelb. E Chlorophyll-Autofluoreszenz in Rot. F Hellfeldbeleuchtung. G Zusammenführung von allen, zeigt BmSWEET1 an der Peripherie der Zellen und ist nicht mit den Zellkernen oder den Plastiden verbunden. H Nahaufnahme einer einzelnen kultivierten B. minutum-Zelle, gefärbt mit Calcofluor für Cellulose in Magenta. I Dieselbe Zelle wie H, markiert für BmSWEET1 in Gelb, J Dieselbe Zelle wie H, die Chlorophyll-Autofluoreszenz in Rot zeigt. K Gleiche Zelle wie H bei Hellfeldbeleuchtung. L Verschmelzung von Calcofluor und BmSWEET1, die zeigt, dass das BmSWEET1-Protein größtenteils die Zellulosewand bedeckt. M Elektronenmikroskopische Aufnahme einer B. minutum-Zelle, die die Zellmembran zeigt, die sich direkt unter der Zellwand befindet.

Immunfluoreszenztests mit diesem Serum zeigen, dass sich BmSWEET1 an der Peripherie der Dinoflagellatenzellen befindet und nicht mit den blauen, DAPI-gefärbten Kernen assoziiert ist (Abb. 2C). BmSWEET1 befindet sich distal zur Autofluoreszenz des roten Chlorophylls, die die Plastiden definiert, und ist wahrscheinlich kein Chloroplastenmembranprotein (Abb. 2E – J). Die gleichzeitige Färbung mit Calcofluor-Weiß, das wir zum Färben von Cellulose-Magenta verwendet haben, zeigt, dass sich das BmSWEET1-Protein an oder direkt unter der äußeren Zellwand befindet (Abb. 2H–M), höchstwahrscheinlich in der Dinoflagellaten-Zellmembran. Wir kommen zu dem Schluss, dass BmSWEET1 überwiegend ein Zellmembranprotein (Plasmamembran) von B. minutum ist.

Um festzustellen, ob BmSWEET1 tatsächlich ein Zuckertransporter ist und welches sein bevorzugtes Substrat ist, haben wir den weit verbreiteten Hefemutanten-Komplementationstest angewendet (18, 25, 26, 28). Die Hefe-Hexose-Transporter-Mutante EBY4000 kann keine Glucose importieren und wächst nicht auf Glucose-Agar [23]. EBY4000 kann mit dem Expressionsplasmid pDR195 transformiert werden, das die Fähigkeit verleiht, auf Glukosemedien zu wachsen, wenn es einen Glukoseimporter exprimiert. Da SWEETs bidirektionale Vermittler sind, die Zucker von hohen zu niedrigen Konzentrationen transportieren können, kann Hefe, die ein funktionelles SWEET exprimiert, ausgewählte Zucker aus dem Medium aufnehmen [18].

Transformanten, die BmSWEET1, Arabidopsis thaliana SWEET1 (einen Glukosetransporter [25]), AtSWEET11 (einen Arabidopsis-Saccharosetransporter [26]) und einen leeren pDR195-Vektor (der kein Transportergen enthält) exprimieren, wurden auf festem SD-Medium mit 2 % Maltose als Kohlenstoff selektiert Quelle bei 30 °C für 4 Tage, dann als Verdünnungsreihe entweder auf Maltose- oder Glucoseplatten getupft, die beide minus Uracil waren, um auf pDR195-haltige Stämme zu selektieren (pDR195 exprimiert auch Orotidin-5′-phosphat-Decarboxylase [URA3], die wird für die Uracil-Biosynthese benötigt).

Alle Stämme wuchsen auf mit Uracil ergänzten Maltoseplatten (Abb. 3A). Nicht transformiertes EBY4000 wuchs nicht auf Maltoseplatten ohne Uracil (Abb. 3B). Wie erwartet konnten die leeren Vektorhefen (pDR195) auf den Maltoseplatten wachsen (Abb. 3A, B), nicht jedoch auf den Glucoseplatten (Abb. 3C). In ähnlicher Weise wuchsen die AtSWEET11-exprimierenden Hefen auf den Maltoseplatten (Abb. 3A, B), nicht jedoch auf den Glucoseplatten (Abb. 3C), was mit AtSWEET11 als Saccharosetransporter übereinstimmt [26]. Umgekehrt wuchs Hefe, die den bekannten Glukosetransporter AtSWEET1 [25] exprimierte, auf Glukose (Abb. 3C). Hefe, die BmSWEET1 exprimiert, wuchs auch auf Glukose (Abb. 3C), was bestätigt, dass BmSWEET1 ein Glukosetransporter ist.

Ein untransformierter Hefestamm EBY4000 und mit dem Expressionsplasmid pDR195 transformierte Stämme, die den Arabidopsis-Glucosetransporter AtSWEET1, den Arabidopsis-Saccharosetransporter AtSWEET11 oder den mutmaßlichen B. minutum-Transporter BmSWEET1 oder einen leeren Vektor enthalten, wachsen alle auf Maltoseplatten (Mal), ergänzt mit Uracil ( Ura). B Wenn Uracil in Maltoseplatten weggelassen wird, wachsen die untransformierten Mutanten (EBY4000) nicht, da sie für Uracil auxotroph sind. C Wenn Maltose durch Glucose (Glc) ersetzt wird, kann nur Hefe überleben, die einen Glucoseimporter exprimiert, nämlich AtSWEET1-Transformanten und BmSWEET1-Transformanten. D Umgekehrt, wenn Maltosesubstrat mit einem toxischen Glucoseanalogon (2-Dexoy-D-Glucose) ergänzt wird, sterben alle Hexose-Import-fähigen Stämme (d. h. AtSWEET1-Transformanten und BmSWEET1-Transformanten) ab, während Hexose-Import-inkompetente Stämme (AtSWEET11 und pDR195) leer sind Vektor) können mit Maltose wachsen und werden nicht durch 2-Dexoy-D-Glucose vergiftet. E Wenn Fruktose (Fru) als Kohlenstoffquelle bereitgestellt wird, wachsen AtSWEET1-Transformanten (die Fruktose importieren können) und in geringerem Maße auch BmSWEET1-Transformanten. Bilder der gesamten Verdünnungsserienplatten sind in Abb. S1 dargestellt.

Als weiteren Test des Glukosetransports durch BmSWEET1 verwendeten wir das toxische Glukoseanalogon 2-Desoxy-D-glukose (Abb. 3D). Auf Maltose plus 2-Desoxy-D-Glucose plattierte Hefetransformanten sterben, wenn sie für den Glukoseimport zuständig sind. Somit wuchsen Hefen, die AtSWEET1 oder BmSWEET1 exprimierten, in diesem Test nicht, während Hefen, die AtSWEET11 oder keinen Transporter (leerer Vektor) exprimierten, erfolgreich wuchsen, weil sie das toxische Glucoseanalogon nicht aufnehmen konnten (Abb. 3D).

Wir haben auch die Fähigkeit von BmSWEET1 getestet, Fruktose zu transportieren (Abb. 3E). Hefen, die AtSWEET1 exprimierten, wuchsen erwartungsgemäß auf Fruktose [35], und ein begrenztes Wachstum von Hefen, die BmSWEET1 exprimierten, war auch auf Fruktose erkennbar (Abb. 3E), was auf eine gewisse Kapazität von BmSWEET1 zum Transport von Fruktose hinweist. Wir kommen zu dem Schluss, dass das optimale Substrat des BmSWEET1-Transporters Glukose ist.

Als nächstes versuchten wir, den Transkriptombeweis zu bestätigen, dass BmSWEET1 häufiger vorkommt, wenn die Algen in einem tierischen Wirt symbiotisch sind [1, 2], indem wir unser Antiserum zur Messung des Proteingehalts verwendeten. Wie andere SWEETs ist BmSWEET1 offenbar ein unregulierter Vermittler der passiven Diffusion, sodass die Expression eines Glukose-Exporteurs im frei lebenden, planktonischen Zustand als schlecht angepasst erscheinen würde. Es ist unwahrscheinlich, dass frei lebende Zellen wertvolle Glukose in den Ozean exportieren, und das Austreten von Glukose in die Umwelt könnte auch algivore Raubtiere anlocken [36]. Umgekehrt wäre von symbiotischen Zellen zu erwarten, dass sie mehr BmSWEET1 exprimieren, um ihren Teil des symbiotischen „Währungsaustauschs“ zu erfüllen [5].

Wir haben versucht, die Menge an BmSWEET1 sowohl in frei lebenden als auch in symbiotischen Algen mithilfe von Western Blot zu messen, aber das Fehlen von Antikörpern gegen andere konstitutiv exprimierte Dinoflagellatenproteine, die als Ladungskontrolle verwendet werden könnten, und hohe Hintergrundwerte in Blots isolierter Symbionten (offenbar verursacht). durch Anemonenkontamination) machte diesen Ansatz überflüssig. Wir haben uns daher entschieden, die Immunfluoreszenzmarkierung von BmSWEET1 in einzelnen Zellen zu quantifizieren – entweder frei lebenden B. minutum-Zellen oder symbiotischen Zellen desselben Stamms, die frisch aus dem Anemonenwirt E. diaphana isoliert wurden (Abb. 4).

In vitro kultivierte AC Breviolum minutum-Zellen. D–F Zellen desselben Stamms, frisch isoliert aus Wirtsanemonen. Beide Zellsätze wurden auf BmSWEET1-Protein immungefärbt und parallel abgebildet, um die Markierungsintensitäten zu vergleichen. Eine BmSWEET1-Markierung in frei lebenden Zellen, die eine relativ schwache BmSWEET1-Markierung aufweist, ist gelb dargestellt. B Hellfeldbeleuchtung. C Zusammenführung aller. D B. minutum-Zellen symbiotisch in einer Wirtsanemone mit intensiver BmSWEET1-Markierung. E Hellfeldbeleuchtung. F Zusammenführung aller. G–J Die Immunfärbung der beiden Populationen (freilebend versus im Krankenhaus) wurde dreimal durchgeführt und die Markierungsintensität wurde für >100 Zellen (n) gemessen und als Box/Whisker-Plots dargestellt. G Fluoreszenzintensität in den frei lebenden Zellen. H Fluoreszenzintensität der In-Hospite-Zellen. I, J Die Hintergrundfluoreszenzintensität wurde in äquivalenten Zahlen von Zellen quantifiziert, die auf ähnliche Weise, jedoch ohne das primäre Antiserum, hergestellt wurden, und ist geringfügig geringer als bei frei lebenden Zellen, die mit dem primären Antikörper markiert wurden (vergleiche G).

Die Antikörpermarkierung und Bildgebung der beiden Algenproben erfolgte parallel unter denselben Bedingungen und Mikroskopeinstellungen (Abb. 4A – F). Markierung und quantitative Vergleiche wurden dreimal durchgeführt und die Fluoreszenzintensität von> 100 Zellen wurde für jede Behandlung quantifiziert (Abb. 4G – J). Die Grundlinien-/Hintergrundmarkierung wurde durch Weglassen des primären BmSWEET1-Antiserums erstellt (Abb. 4I, J). Die Quantifizierung zeigt, dass die Algen im Gastland deutlich mehr BmSWEET1-Protein haben (Abb. 4H) als im freien Leben (Abb. 4G). Um die unterschiedliche Zugänglichkeit von Antikörpern für die frei lebenden Zellen im Vergleich zu den frisch isolierten symbiotischen Zellen zu kontrollieren, haben wir die Zellwanddicke gemessen, was zeigte, dass sich die mittlere Wanddicke in den beiden Gruppen nicht unterschied (Abb. S2). Die symbiotischen Dinoflagellaten existieren bei geringerer Lichtintensität (15 μmol m−2 s−1 Photonen) als ihre frei lebenden, in vitro kultivierten Gegenstücke (60 μmol m−2 s−1 Photonen, siehe Materialien und Methoden). Um sicherzustellen, dass die Lichtintensität keinen Einfluss auf die Menge des BmSWEET1-Proteins hatte, führten wir eine Immunfluoreszenz an zwei Kulturen durch: eine mit 60 μmol m−2 s−1 Photonen und eine andere mit 15 μmol m−2 s−1 Photonen. Bei unterschiedlichen Lichtintensitäten wurde in vitro kein signifikanter Unterschied in der BmSWEET1-Immunfluoreszenzmarkierung beobachtet (Abb. S3).

Interessanterweise sind die Markierungsniveaus im frei lebenden Zustand (Abb. 4G) kaum höher als bei den Negativkontrollen, bei denen das primäre Antiserum weggelassen wurde (Abb. 4I, J), was mit unserer Hypothese einer minimalen BmSWEET1-Expression während dieses Zeitraums übereinstimmt Lebensphase, um den verschwenderischen Glukoseexport oder die Gefahr, Algivoren anzulocken, zu minimieren [36]. Es wird angenommen, dass vom Wirt sezernierte Faktoren den Export von fixiertem Kohlenstoff aus Dinoflagellaten-Symbionten induzieren [37,38,39], und verschiedene Pflanzenpathogene sind in der Lage, Pflanzen-SWEETs hochzuregulieren, um Zugang zum Wirtszucker zu erhalten [40], daher wird es interessant sein, herauszufinden, was verursacht die erhöhte Expression von BmSWEET1 im Hospite.

Wir kommen zu dem Schluss, dass BmSWEET1 in symbiotischen Algen hochreguliert und möglicherweise stabiler ist, was im Einklang damit steht, dass es ein Glukoseexporteur ist, der seinen Wirt ernähren kann.

Wir konzentrierten uns auf einen mutmaßlichen Glukosetransporter, BmSWEET1, im symbiotischen Dinoflagellaten B. minutum, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er im Gastland im Vergleich zu Freileben auf der Ebene der Genexpression hochreguliert ist [1]. Sequenzanalyse und Strukturmodellierung legten nahe, dass BmSWEET1 ein unterstützender Zuckertransporter ist, der Zucker bei der Diffusion entlang eines Konzentrationsgradienten unterstützen würde. Wir haben BmSWEET1 auf der Zellmembran des Symbionten lokalisiert. Wir haben gezeigt, dass BmSWEET1 Glukose transportiert, indem es eine Hefemutante mit Hexoseimportmangel ergänzt. Schließlich haben wir durch quantitative Mikroskopie gezeigt, dass B. minutum-Dinoflagellaten, die in Anemonenwirten leben, wesentlich mehr BmSWEET1 in ihren Zellmembranen enthalten als frei lebende Zellen desselben Stamms.

BmSWEET1 verfügt somit über drei Eigenschaften, die es zu einem wahrscheinlichen Kandidaten für den symbiotischen Exporteur von Glukose in Dinoflagellaten-Wirbellosen-Symbiosen machen: i/ geeigneter Standort (Algenzellmembran), ii/ richtiges Substrat (Glukose) und iii/ deutlich höheres Expressionsniveau im Hospit. Mit der Photosynthese von Dinoflagellaten als Glukosequelle und der Atmung des Wirtstiers als Glukosesenke ist BmSWEET1 ein ideales Tor, um die Diffusion von Glukose vom Endosymbionten zu seinem Wirt zu erleichtern und so Korallen zu ernähren, um die Entstehung von Korallenriffen zu unterstützen.

Die im Manuskript beschriebenen Materialien, einschließlich aller relevanten Rohdaten, sind auf Anfrage frei verfügbar.

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Diese Studie wurde durch Discovery Grants des Australian Research Council (DP160101539 an GIM und MvO, DP210100639 an GIM und DP180102630 an MJHvO) und Laureate Fellowships des Australian Research Council (FL170100008 an GIM und FL180100036 an MJHvO) unterstützt. APMW und ME freuen sich über die Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft durch den SFB1535 „MiBiNet“. Wir danken Eckhard Boles für die Bereitstellung des EBY4000-Stammes.

Cooler Maor-Landaw

Aktuelle Adresse: Abteilung für Meeresbiologie, Leon H. Charney School of Marine Sciences, Universität Haifa, Haifa, Israel

Marion Eisenhut

Aktuelle Adresse: Computational Biology, Fakultät für Biologie, CeBiTec, Universität Bielefeld, Bielefeld, Deutschland

Jade Tortorelli

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School of Biosciences, The University of Melbourne, Parkville, VIC, Australien

Keren Maor-Landaw, Giada Tortorelli, Allison van de Meene, Madeleine JH van Oppen und Geoffrey I. McFadden

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Marion Eisenhut, Samantha Kurz & Andreas P. M. Weber

Plattform für biologische optische Mikroskopie, Universität Melbourne, Parkville, VIC, Australien

Gabriela Segal

Australisches Institut für Meereswissenschaften, Townsville, Queensland, Australien

Madeleine JH van Oppen

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KM-L, ME, MJHvO, APMW und GIM trugen zur konzeptionellen Entwicklung und der endgültigen redigierten Version des Manuskripts bei. KM-L, ME, GT, AvdM, SK und GS führten die Experimente durch. KM-L, ME, MJHvO, APMW und GIM haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Geoffrey I. McFadden.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Maor-Landaw, K., Eisenhut, M., Tortorelli, G. et al. Ein möglicher Transporter, der es symbiotischen Dinoflagellaten ermöglicht, ihre Korallenwirte zu ernähren. GEMEINSAMES ISME. 3, 7 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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Eingegangen: 02. November 2022

Überarbeitet: 10. Januar 2023

Angenommen: 18. Januar 2023

Veröffentlicht: 28. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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