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Aug 10, 2023

Dynamisches HIV

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6393 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Impfstoffe, die auf das gp160-Spike-Protein von HIV-1 abzielen, werden durch hohe virale Mutationsraten und strukturelle Schikanen behindert. Die membrannahe äußere Region (MPER) von gp160 ist das Ziel natürlich vorkommender breit neutralisierender Antikörper (bnAbs), doch MPER-basierte Impfstoffe erzeugen keine bnAbs. Hier wurde das in Nanoscheiben eingebettete Spike-Protein mittels Kryo-Elektronenmikroskopie und molekulardynamischen Simulationen untersucht und dabei eine spontane Neigung der Ektodomäne aufgedeckt, die eine Anfälligkeit für HIV-1 schafft. Während jedes MPER-Protomer zentral in Richtung der dreizähligen Achse strahlt und zu einer membranassoziierten Stativstruktur beiträgt, die im aufrechten Dorn eingeschlossen ist, ermöglicht das Kippen den Zugang zum gegenüberliegenden MPER. Strukturen von Spike-Proteinen mit gebundenen 4E10-bnAb-Fabs zeigen, dass der Antikörper exponiertes MPER bindet, wodurch die MPER-Dynamik verändert, die durchschnittliche Neigung der Ektodomäne modifiziert und eine Belastung auf die Virusmembran und die Transmembransegmente des Spikes ausgeübt wird, was zur Aufhebung der Membranfusion führt und die Zukunft informiert Impfstoffentwicklung.

Es wird angenommen, dass die Entstehung des Humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) als Krankheitserreger beim Homo sapiens um 1920 in der Demokratischen Republik Kongo stattgefunden hat, als das Retrovirus vom Schimpansen auf den Menschen übersprang, woraufhin die aktuelle Epidemie begann die 1970er1,2. Die Bedeutung dieser Zoonose wird durch die in den letzten 35 Jahren zusammengestellten Daten bestätigt, die darauf hinweisen, dass sich weltweit etwa 78.000.000 Menschen infiziert haben und etwa 35.000.000 Menschen trotz antiviraler Arzneimitteltherapie mit mehreren Wirkstoffen gestorben sind3.

Das trimere HIV-1-Hüll-Spike-Protein gp160 (Env), ein Transmembran-Glykoprotein, das jeweils aus drei Protomeren gp120 und gp41 besteht, ist das einzelne, vom Virus abgeleitete Protein auf dem Virion. Daher ist es das einzige Ziel schützender Antikörper, die bei Patienten auf natürliche Weise entstehen oder bei nicht infizierten Personen durch Impfung hervorgerufen werden4,5,6. Allerdings hat die Impfung mit der Induktion von Antikörpern mit der erforderlichen Breite gegen verschiedene Virusstämme, sogenannten breit neutralisierenden Antikörpern (bnAbs), keine Antikörper erzeugt, die entweder die anfängliche Bindung des Virus an menschliche CD4-T-Zellen blockieren oder nachfolgende Env-Konformationsänderungen hemmen begleitende Fusionsereignisse, die für den Eintritt des Virus nach der Bindung in die Wirtszelle erforderlich sind (Übersicht in Lit. 7). Die Immunerkennung von Env wird durch seine außergewöhnliche Sequenzvariabilität8, die dichte Glykosylierung9,10 und die Konformationsmaskierung von Schlüsselstellen und metastabilen Zuständen11 behindert. Dennoch entwickeln einige chronisch HIV-1-infizierte Patienten im Laufe der Jahre der Infektion bnAbs4,5,6. Die damit einhergehende virale Diversifizierung und umfangreiche somatische Antikörpermutationen verbessern die Bindungsaffinität und optimieren die Übereinstimmung zwischen Paratopen und Epitopen12. BnAbs richten sich gegen die CD4-Bindungsstelle sowie die V1V2- und V3-Glykanstellen auf gp120, die gp41-gp120-Schnittstellenregion und die gp41-membranproximale externe Region (MPER)4,5,6. Der MPER, der die Env-Ektodomäne mit seiner Transmembrandomäne (TM) verbindet, gehört zu den am stärksten konservierten HIV-1-Segmenten aller Kladenstämme13. Diese Konservierung und die Beobachtung, dass natürlich vorkommende, auf MPER gerichtete bnAbs die größte Neutralisierungsbreite aufweisen, haben den MPER zu einem Schlüsselziel für die Impfstoffentwicklung gemacht.

Die Struktur des MPER selbst und zusammen mit der TM-Domäne in einer membranmimetischen Umgebung wurde eingehend mit spektroskopischen Methoden untersucht und dabei festgestellt, dass das MPER-Peptid dazu neigt, eine in die Membran eingebettete geknickte Helix-Gelenk-Helix-Konformation mit zusätzlicher flankierender Flexibilität anzunehmen13 ,14 und legt nahe, dass bnAb-gebundenes MPER teilweise aus der Membran extrahiert wird15. MPER-Peptid-Impfstoffe konnten jedoch keine bnAbs hervorrufen, und die genaue Anordnung des MPER als Teil des gesamten membraneingebetteten Env-Trimers bleibt umstritten. Eine Kryo-Elektronentomographie-Studie (Kryo-ET) berichtete, dass die MPERs eine stativartige Struktur bilden, die aus drei getrennten Helices besteht16, andere Kryo-ET-Studien zeigten jedoch, dass die drei MPER-Segmente in einem kompakten Stiel organisiert sind17,18. Daher ist für ein rationales Impfstoffdesign eine hochauflösende Struktur erforderlich, um die tatsächliche Anordnung des MPER im Kontext sowohl einer Lipiddoppelschicht als auch der vollständigen und glykosylierten Ektodomäne des Env-Trimers aufzuklären.

Hier rekonstituieren wir das in Säugetierzellen exprimierte HIV-1-Env-Protein in Lipid-Nanoscheiben und verwenden Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), um seine Struktur allein sowie im Komplex mit bis zu drei Fabs des bnAb 4E10 zu bestimmen. Zusammen mit grobkörnigen Molekulardynamiksimulationen (CGMD) offenbaren diese Strukturen die Dynamik der Env-Ektodomäne und des MPER auf der Membran. Darüber hinaus werden die Konformationsänderungen im MPER sowie abgeleitete Störungen in vicinalen Lipiden und TM-Domänen ermittelt, die mit der Bindung einer zunehmenden Anzahl dieser 4E10-Fabs einhergehen.

Das gp145-SOSIP-Konstrukt19 des Env-Spike-Proteins aus dem BG505-Clade-A-Stamm, bestehend aus der gesamten Ektodomäne (Reste 1–662), den MPER- und Transmembransegmenten und 17 Resten der zytoplasmatischen Domäne (Abb. 1a), wurde in HEK293 exprimiert Zellen. Das C-terminal verkürzte Env-Konstrukt wurde aufgrund seiner deutlich besseren Expression im Vergleich zum Protein voller Länge verwendet. Nach der Reinigung in Dodecylmaltosid (DDM) unter Verwendung des PG9 Fab für die Affinitätschromatographie, gefolgt von Größenausschlusschromatographie (SEC) (ergänzende Abbildung 1a, b), wurde das rekombinante gp145 mit einer molaren 1,5:1:1,07-Mischung von in Nanodiscs rekonstituiert Palmitoyloleylphosphatidylcholin (POPC), Palmitoyloleylphosphatidylglycerol (POPG) und polarer Gehirnlipidextrakt. Diese Lipidmischung ähnelt in ihrer Zusammensetzung der der HIV-1-Membran20, außer dass ihr Cholesterin fehlt. Obwohl Cholesterin der am häufigsten vorkommende Bestandteil des HIV-1-Lipidoms ist, zeigten unsere CGMD-Simulationen, die mit einer Membran durchgeführt wurden, die 20 % Cholesterin enthielt, ein dynamisches Verhalten der Ektodomäne, insbesondere Neigungswinkel, die mit denen in unseren Kryo-EM-Karten übereinstimmten (siehe). unten). Leere Nanoscheiben wurden von SEC entfernt (ergänzende Abbildung 1a). Die SDS-PAGE-Analyse der SEC-Peakfraktion bestätigte das Vorhandensein von gp145 und dem Membrangerüstprotein MSP1D1dH5, das für den Nanoscheibenaufbau verwendet wurde (ergänzende Abbildung 1b). EM-Bilder von negativ gefärbtem gp145 in DDM zeigten meist dreifach symmetrische Draufsichten von gp145 (ergänzende Abbildung 1c), während negativ gefärbte EM-Bilder von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 Seitenansichten zeigten und die Nanoscheiben enthüllten (ergänzende Abbildung 1d). Anschließend wurde in Nanoscheiben eingebettetes gp145 mit dem Fab-Fragment von bnAb 4E10 inkubiert, mit BS3 vernetzt und auf Gittern vitrifiziert. Die Bildverarbeitung mit RELION-3 zeigte, dass ~80 % der ausgewählten Partikel keine offensichtliche Dichte für den 4E10-Fab aufwiesen. Die weitere Verarbeitung dieser Partikel ergab eine Dichtekarte von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 mit einer Gesamtauflösung von 3, 9 Å (Abb. 1b und ergänzende Abbildungen 2–4). Diese Karte ermöglichte es uns, ein Atommodell für die Ektodomänenreste 31–662 und ein Rückgratmodell für die Reste 663–671 zu erstellen (weitere Einzelheiten finden Sie unter „Methoden“). Die Karte löste die Transmembranhelices nicht auf, die auch in einer früheren Karte des in Nanoscheiben eingebetteten Env-Proteins voller Länge21 nicht aufgelöst wurden, was höchstwahrscheinlich auf Variationen in der Position der Single-Span-TM-Domänen relativ zur Nanoscheibe zurückzuführen ist. Eine zusätzliche Dichte mit niedriger Auflösung (~ 5 Å; ergänzende Abbildung 4b) stellte jedoch den Beginn des MPER-N-Segments dar, in das wir das N-terminale Segment einer NMR-Struktur des MPER (PDB: 2PV6)14 platzierten ( Ergänzende Abbildung 4d), die die Anordnung des MPER im Kontext einer Membran und der trimeren Env-Ektodomäne offenbart. Die MPER-N-Segmente jedes Protomers bilden drei unabhängige Helices, die eine stativartige Konformation annehmen (Abb. 1b, c), die sich von den zuvor berichteten Strukturen unterscheidet, in denen die MPERs entweder konvergieren16 oder einen kompakten Stiel bilden17,18.

eine Domänenarchitektur von gp160. FP, Fusionspeptid; NHR, N-terminale Heptad-Wiederholung; CHR, C-terminale Heptad-Wiederholung (orange); MPER-N (grün); MPER-C (Magenta); TM, Transmembrandomäne; CT, zytoplasmatischer Schwanz. Die Zahlen oben geben die ersten Reste der Segmente an, die Zahlen darunter die letzten. b Links: Kryo-EM-Karte von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 auf einem niedrigen Konturniveau (0,011). Die Dichte der Nanoscheibe wird in hellgelb angezeigt. Rechts: Kryo-EM-Karte von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 auf einem höheren Konturniveau (0,014), dargestellt in halbtransparentem Grau, wobei die modellierte gp145-Struktur, dargestellt in Banddarstellung, in die Karte passt. Die CHR-Region wird in Orange und das MPER-N-Segment in Grün dargestellt. Der Rest der Ektodomäne ist blau dargestellt. c Links: Struktur von gp145 gesehen parallel (oben) und senkrecht zur Membranebene (unten). Rechts: Dieselben Ansichten wie im linken Bereich nach dem Hinzufügen der NMR-Struktur des vollständigen MPER (PDB: 2PV6) zu unserem gp145-Modell (basierend auf einer Überlagerung der MPER-N-Segmente). Die CHR-Region wird in Orange, das MPER-N-Segment in Grün und das MPER-C-Segment in Magenta dargestellt. d Platzierung der beiden verfügbaren NMR-Strukturen von MPER-TM in der Kryo-EM-Karte (platziert basierend auf der Position der MPER-N-Segmente). Die Tripod-Struktur (PDB: 6DLN) passt gut in die Karte (links), wohingegen die MPER-N-Segmente der Stiel-Blasen-Struktur (PDB: 6E8W) schlecht mit der Kryo-EM-Karte übereinstimmen, da die Transmembranhelices weit aus der Karte herausragen Nanoscheibendichte (rechts). e Drei Kryo-EM-Karten von in Nanoscheiben eingebettetem gp145, die zeigen, dass die gp145-Ektodomäne einen weiten Winkelbereich in Bezug auf die Membranebene einnimmt. Die Karten werden als halbtransparente Flächen und die Struktur der Ektodomäne als farbige Bänder dargestellt. Die Abstände wurden vom Ende der Ektodomäne (Rest Ala662) bis zur Mitte der Nanoscheibe (angezeigt durch die gestrichelte Linie) gemessen.

Unsere Struktur zeigt, dass das MPER-N-Segment teilweise in der Lipiddoppelschicht vergraben ist (Abb. 1b), was mit einer früheren NMR-Struktur übereinstimmt, die zeigte, dass das MPER in der Membran eingetauchte helikale Segmente bildet 14 . Aufgrund eines Gelenks, das die MPER-N-Helices mit den MPER-C-Helices verbindet14, und des Mangels an verlässlicher Dichte für das MPER-C-Segment und die TM-Region gibt unsere Karte keine Auskunft über die Position der MPER-C-Segmente oder deren Organisation die TM-Helices. Allerdings ist es, wie unten erläutert, wahrscheinlich, dass sich jedes MPER-C-Segment zurück in Richtung der Mitte des Env-Trimers erstreckt und dass sich die MPER-verknüpften TM-Domänen jedes Protomers entweder in loser Assoziation oder in der Nähe der dreifachen Trimerachse annähern Alternativ bezieht sich eines auf das TM-Bündel, das in zwei NMR-Strukturen von MPER-TM22,23 beobachtet wurde. Bemerkenswert ist, dass andere Studien darauf hindeuten, dass die TM-Helices im nativen Trimer-Spike kein starres Trimer24 bilden, sondern während des viralen Fusionsprozesses in eine solche Konfiguration übergehen könnten. In einer der NMR-Strukturen (PDB: 6E8W)22 bilden die MPER-C-Segmente mit ihren jeweiligen TM-Domänen einigermaßen kontinuierliche Helices, obwohl die MPER-C-Helices verzerrt sind und sich von der dreizähligen Achse wegbiegen. Der Gelenkbereich zwischen den MPER-C- und -N-Segmenten bildet dann starke Knicke, was dazu führt, dass sich die MPER-N-Segmente der dreizähligen Achse annähern. Wir werden dies als Stiel-Blasen-Konformation bezeichnen. In der anderen NMR-Struktur (PDB: 6DLN)23 sind es die Scharniere zwischen TMD und MPER-C, die starke Knicke bilden, während die MPER-C- und -N-Segmente eine kontinuierliche Helix bilden, die sich von der dreifachen Helix weg erstreckt. eine Stativkonformation bilden.

Um die Konformation des MPER im Kontext des vollständigen Env-Trimers zu vergleichen, haben wir den Abstand zwischen dem N-terminalen Ende der MPER-Segmente, dh dem Cα-Atom des Rests Lys665, zwischen benachbarten Protomeren gemessen. In unserer Kryo-EM-Struktur beträgt der Abstand 30 Å, während der Abstand in der NMR-Stativstruktur 53 Å und in der NMR-Stiel-Blasen-Struktur 16 Å beträgt (ergänzende Abbildung 5a). Die Messung ergab, dass die MPER-Segmente in unserer Struktur eine Konformation annehmen, die zwischen den beiden NMR-Strukturen liegt. Die Trp666-Reste der drei MPER-N-Protomere konvergieren jedoch in der Stiel-Blasen-Konformation und bilden einen hydrophoben Kern, was in der Kryo-EM-Struktur nicht der Fall ist (ergänzende Abbildung 5b). Darüber hinaus passt die Dimension der NMR-Stativstruktur durch die Platzierung der beiden NMR-Strukturen in der Kryo-EM-Karte unter Verwendung der MPER-N-Segmente als Ankerpunkte viel besser in die Karte, was zeigt, dass diese Struktur näher an der MPER-Konformation in liegt Kontext des gesamten Env-Proteins (Abb. 1d). Der verbleibende Unterschied in der MPER-Konformation zwischen der NMR-Stativstruktur und unserer Kryo-EM-Struktur ist höchstwahrscheinlich auf Einschränkungen zurückzuführen, die dem MPER durch die Ektodomäne auferlegt werden, die in der Kryo-EM-Studie vorhanden war, in der NMR-Studie jedoch fehlte.

Die Datenverarbeitung von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 ergab, dass die Ektodomäne einen weiten Winkelbereich in Bezug auf die Membranebene einnehmen kann. Um den Bereich der Ektodomänenneigung besser zu charakterisieren, führten wir iterative 3D-Klassifizierungen durch (ergänzende Abbildung 3), was zu 20 Karten mit wohldefinierter Dichte für die Nanoscheibe und ausreichenden Merkmalen in der Ektodomänendichte führte, um das Atommodell eindeutig anzudocken (Beispiele gezeigt in). Abb. 1e). Ein aus den angedockten Modellen erstellter Film veranschaulicht den Grad der Neigung, den das Env-Trimer relativ zur Nanodisc-Membran erfahren kann (Zusatzfilm 1). Die Karten zeigen, dass die dreizählige Achse der Ektodomäne um mindestens 30° gegenüber der Membrannormalen geneigt sein kann (Abb. 1e und Zusatzfilm 2). Durch die Neigung vergrößert sich der Abstand der Ektodomäne von der Membranoberfläche um bis zu 20 Å (Abb. 1e).

Um die Dynamik der Ektodomäne auf der Membran besser zu verstehen, verwendeten wir CGMD-Simulationen (Abb. 2a). gp145 wurde in eine POPC-Doppelschicht mit 20 % Cholesterin eingebettet, da die HIV-1-Membran bekanntermaßen reich an Cholesterin ist20. Die Simulationen bestätigten die Kryo-EM-Ergebnisse darin, dass die Ektodomäne sehr mobil ist (Zusatzfilm 3) und bis zu ~63° neigen kann. Aus fünf 10-μs-Simulationen geht hervor, dass die Ektodomäne im Durchschnitt um 17,6° ± 10,0° geneigt ist, aber einen weiten Neigungsbereich annimmt (Abb. 2b). Die CGMD-Simulationen zeigen auch, dass die MPERs sehr dynamisch sind und gelegentlich die Membranebene verlassen (Zusatzfilm 3), es gibt jedoch keine Hinweise darauf, dass die MPER-Bewegungen mit der Neigung der Ektodomäne korrelieren. Die Umwandlung von CGMD-Schnappschüssen in atomistische Ansichten zeigte auch, dass hohe Neigungen der Ektodomäne per se die Extraktion des MPER aus der Membran nicht begünstigten (Abb. 2c).

a Das System aus membraneingebettetem gp145, das für grobkörnige Molekulardynamiksimulationen (CGMD) verwendet wird. Die gp145-Ektodomäne wird in Grau, CHR in Orange, MPER-N in Grün und MPER-C in Magenta dargestellt. Die Lipiddoppelschicht ist gelb dargestellt. b Diagramm, das die Verteilung der Neigungswinkel der gp145-Ektodomäne zeigt und die Daten aller fünf Wiederholungen zusammenfasst. Die durchgezogene Linie stellt den Mittelwert dar und das graue Band gibt die Standardabweichung an. Die vertikale Linie bei 18° ist die durchschnittliche Gesamtneigung der Ektodomäne. c Zwei Schnappschüsse aus den CGMD-Simulationen, umgewandelt in Gesamtatomansichten, die zwei stark geneigte gp145-Ektodomänen zeigen. Die Neigung der Ektodomäne scheint nicht damit zu korrelieren, dass das gegenüberliegende MPER-C-Segment (Pfeil) entweder im Lipid eingetaucht (oberes Bild) oder freigelegt (unteres Bild) ist.

Die CGMD-Ergebnisse zeigten, dass die MPER-spezifische bnAb-Bindung an gp145 von zwei unabhängigen Dynamiken abhängt: (1) der Neigung der Ektodomäne, um den MPER für das Fab sterisch zugänglich zu machen, und (2) MPER-Bewegungen, die das Epitop ausreichend von der Membran aus freilegen Bevorzugen Sie die Fab-Bindung. Unsere Verwendung des strukturell gut charakterisierten bnAb 4E10, der das MPER-Gelenk und die C-Helix25,26 erkennt, ermöglichte es, diese Annahme zu testen. Die Inkubation des in die Nanoscheibe eingebetteten gp145 mit einem 100-fachen molaren Überschuss an 4E10-Fab führte dazu, dass etwa 20 % der vitrifizierten Ektodomänen von mindestens einem Fab-Molekül gebunden wurden. Durch 2D-Klassifizierung negativ gefärbter Partikel ermittelte Projektionsmittelwerte zeigten, dass ein bis drei Fabs an ein gp145 gebunden sein könnten (Abb. 3a). Nach umfangreicher Verarbeitung der vitrifizierten Fab-gebundenen Partikel konnten wir Dichtekarten von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 im Komplex mit einem 4E10-Fab (gp145•1Fab) mit einer Auflösung von 8,8 Å und zwei 4E10-Fabs (gp145•1Fab) erstellen. bei einer Auflösung von 8,2 Å und mit drei 4E10-Fabs (gp145·1Fab) bei einer Auflösung von 3,7 Å (Abb. 3b und ergänzende Abb. 2). Trotz der begrenzten Auflösung von zwei der Karten, die in der Fab-Bindungsregion nur ~12 Å beträgt (ergänzende Abbildung 4b), zeigten die Merkmale der zusätzlichen Dichte, dass diese gebundene Fabs darstellten, und ermöglichten das Andocken des 4E10-Fab-Kristalls Struktur (PDB: 1TZG)25 (Ergänzende Abbildung 6). Bemerkenswerterweise zeigen die Karten zwei unterschiedliche Modi, in denen der MPER-spezifische 4E10-Fab an gp145 bindet. Die gp145·1Fab-Karte veranschaulicht den Bindungsmodus 1, bei dem sich das Fab von der Nanoscheibe fast parallel zur Membranoberfläche, aber leicht von der Membranebene weg in die gleiche Richtung wie die Ektodomäne erstreckt und wobei die Ebene des Fab parallel zu der der Membranebene verläuft Membran. In der gp145·2Fab-Karte weist ein 4E10-Fab ebenfalls Bindungsmodus 1 auf, aber der zweite Fab ist im Modus 2 gebunden, in dem sich der Fab in die entgegengesetzte Richtung zur Ektodomäne erstreckt und Raum einnimmt, der normalerweise der des Lipids wäre Doppelschicht. Darüber hinaus ist die Fab-Ebene um ~90° gedreht und steht somit nahezu senkrecht zur Membranebene. Schließlich sind in der gp145·3Fab-Karte alle drei Fabs im Bindungsmodus 2 an gp145 gebunden. Da alle drei Fabs nun den Raum einnehmen, der normalerweise von der Membran eingenommen würde, zeigt diese Karte keine Dichte, die die Nanoscheibe darstellen würde.

ein repräsentatives EM-Bild mit negativer Färbung von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 nach Inkubation mit 4E10-Fab (links) und 2D-Klassendurchschnitten, die gp145 mit ein bis drei gebundenen 4E10-Fabs zeigen (rechts). Maßstabsleiste: 50 nm; Seitenlänge der Mittelwerte: 34 nm. b Kryo-EM-Karten von gp145 mit einem, zwei und drei gebundenen 4E10-Fabs. Die Karten wurden automatisch mit dem Befehl „Farbzone“ in Chimera segmentiert. Die Ektodomäne und die Nanoscheibe sind in Hellgrau gefärbt und die Fabs 1 bis 3 sind in Gelb, Gold bzw. Braun gefärbt. Sternchen geben die Dichte an, die das zur Reinigung verwendete PG9-Fab repräsentiert.

Um die Karten mittlerer Auflösung von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 im Komplex mit einem und zwei 4E10-Fabs zu analysieren, haben wir den 4E10-Fab im Komplex mit dem MPER-C-Peptid (PDB: 1TZG) angedockt (ergänzende Abbildung 6). Die lange komplementaritätsbestimmende Region 3 in der schweren Kette (CDRH3) von 4E10 ist stark hydrophob und 4E10 nutzt seine CDRH1- und CDRH3-Schleifen, um Lipide zu binden26, was bedeutet, dass diese CDRs eine Interaktionsoberfläche mit der Lipiddoppelschicht bilden. In unserer Struktur des in Nanoscheiben eingebetteten gp145 selbst ist die Ektodomäne senkrecht zur Membranebene ausgerichtet (Abb. 4a). Damit der 4E10-Fab jedoch an gp145 binden kann, muss die Ektodomäne um ~25° geneigt sein (Abb. 4b). Ein ähnlicher Neigungswinkel wurde kürzlich in einer Kryo-EM-Struktur des Env-Proteins voller Länge des Stammes AMC011 im Komplex mit dem Fab von VRC42.0121 beobachtet. Die Ektodomäne in unserer gp145·2Fab-Struktur zeigte einen ähnlichen Neigungswinkel von ~25° (Abb. 4c). Wir haben auch den Abstand der gp145-Ektodomäne von der Membranoberfläche gemessen. Für gp145 allein beträgt der Abstand zwischen Glu662 (dem Ende der C-terminalen Heptad-Wiederholung; CHR) und Trp666 (dem Anfang des in die Membran eingetauchten MPER) ~10 Å. In der gp145·1Fab-Struktur erhöht sich dieser Abstand auf ~20 Å. In der gp145·2Fab-Struktur erhöht sich der Abstand weiter auf ~40 Å für das zweite Fab. Wir fanden einen ähnlichen Abstand von ~40 Å, als wir die Atommodelle von Env und den Komplex des an sein MPER-Epitop gebundenen 10E8-Fab (PDB: 4U6G) in die veröffentlichte Kryo-EM-Karte der Env-Ektodomäne des AMC011-Stammes andockten zwei gebundene 10E8 Fabs (Abb. 4d)21. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Env-Ektodomäne im Komplex mit MPER-zielenden bnAbs geneigt und von der Membran abgehoben ist.

a Das Kryo-EM-Modell von gp145 selbst (Ektodomäne in Grau, CHR in Orange und MPER-N in Grün) mit hinzugefügten MPER-C-Segmenten aus einer NMR-Struktur (PDB: 2PV6), das zeigt, dass die MPERs in Membranen eingebettet sind Der Abstand der Ektodomäne (Rest Ala662) von der Membranoberfläche beträgt ~10 Å. b Modell von gp145 mit einer 4E10-Fab-Bindung (gelb gefärbt), das zeigt, dass die Ektodomäne geneigt ist, wodurch sich ihr Abstand von der Membran auf ~20 Å vergrößert, und dass das MPER-C-Segment (Magenta) freigelegt und ungefähr senkrecht ausgerichtet sein muss zur Membranebene (Bindungsmodus 1). c Modell von gp145 mit zwei gebundenen 4E10-Fabs (in Gelb und Gold gefärbt), das zeigt, dass die Ektodomäne geneigt bleibt und dass die beiden Fabs sehr unterschiedlich binden. Während ein Fab den gleichen Bindungsmodus 1 wie in Panel (b) zeigt, hebt der zweite Fab das MPER-C-Segment auf ~40 Å von der Membran ab, wo es ungefähr parallel zur Membran verläuft (Bindungsmodus 2); Dieser Fab nimmt den Raum ein, der normalerweise von der Membran eingenommen wird. d Modell von gp160 mit zwei gebundenen Fabs von bnAb 10E8 (blau gefärbt), erzeugt durch Andocken der Kristallstruktur des 10E8 Fab-MPER-Epitop-Komplexes (PDB: 4U6G) in die Kryo-EM-Karte von 10E8 Fab, gebunden an das Env-Protein von der Stamm AMC011 (EMDB: 21334). Das Modell zeigt, dass die Ektodomäne nicht geneigt und dennoch etwa 40 Å von der Membranoberfläche entfernt ist und dass beide 10E8-Fabs MPER-C ähnlich wie 4E10-Bindungsmodus 1 binden. e Kryo-EM-Struktur von gp145 mit drei gebundenen 4E10-Fabs (eingefärbt). Gelb, Gold und Braun), gesehen parallel (oben) und senkrecht zur Membranebene (unten). Obwohl die Bindung asymmetrisch ist, weisen alle drei Fabs den Bindungsmodus 2 auf. Die Farbcodierung ist dieselbe wie in den Abbildungen. 1–3.

Das vom 4E10-Fab gebundene MPER-C-Segment (Reste 674–683) nimmt eine wesentlich andere Ausrichtung an als im ungebundenen Zustand. In unserer Struktur von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 sollten die MPER-C-Segmente größtenteils parallel zur Membran verlaufen und teilweise in die Lipiddoppelschicht eingetaucht sein (Abb. 4a). Im Gegensatz dazu zeigt unser Modell für den gp145·1Fab-Komplex, dass das vom ersten Fab im Bindungsmodus 1 gebundene MPER-C-Segment aus der Membran extrahiert wird, wobei das C-terminale Ende des MPER nahe an der Membranoberfläche verbleibt, aber das Das MPER-C-Segment ist jetzt in einem Winkel von ~80° zur Membranebene ausgerichtet (Abb. 4b). Die Bindung des zweiten Fab im Bindungsmodus 2 führt zu einer weiteren Entfernung des MPER-C-Segments, das nun fast parallel zur Membran verläuft, jedoch in einem Abstand von nahezu 40 Å (Abb. 4c). Diese Position des MPER-C-Segments würde eine Extraktion der TM-Helix erfordern und daher wahrscheinlich nicht in situ auftreten. Dies impliziert jedoch, dass die Fab-Bindung eine erhebliche Zugkraft auf die TM-Helix ausübt, was wahrscheinlich zu einer Störung der Transmembranregion führt und möglicherweise sogar eine gewisse Extraktion der Helix aus der Membran. Bemerkenswert ist, dass die drastische Neuausrichtung des MPER-C-Segments, die bei der Bindung des zweiten Fab im Bindungsmodus 2 beobachtet wird, in der modellierten Struktur der Env-Ektodomäne mit zwei gebundenen 10E8-Fabs nicht beobachtet wird (Abb. 4d). In dieser Struktur nehmen beide MPER-C-Segmente eine Konformation an, wie sie für die 4E10-Fabs beobachtet wird, die im Bindungsmodus 1 in den gp145·1Fab- und gp145·2Fab-Strukturen gebunden sind. Der Unterschied in den 4E10- und 10E8-gebundenen Strukturen kann mit der größeren Hydrophobie und Lipidbindung der Membraninteraktionsoberfläche von 4E1014,27 und/oder mit der verkürzten C-terminalen Domäne von gp145, die für die Komplexbildung mit 4E10 verwendet wird, zusammenhängen.

Die 3,7-Å-Auflösung der gp145·3Fab-Karte ermöglichte es uns, ein Atommodell für die Ektodomäne sowie den gesamten MPER für eine der Untereinheiten und Rückgratmodelle für die MPERs der anderen beiden Untereinheiten zu erstellen und so aufzudecken, wie der MPER ist mit ersterem verbunden (Abb. 4e, ergänzende Abb. 4f und 7a). Allerdings beobachteten wir weder eine Dichte für die Nanoscheibe noch für die TM-Helices, was darauf hindeutet, dass die Bindung von drei 4E10-Fabs zur vollständigen Extraktion des Trimers aus der Nanoscheibe führt. Eine vorherige direkte Messung der 4E10-Fab-Bindung an MPER-Peptid auf HIV-1-Virus-mimetischen Liposomen mittels isothermer Titrationskalorimetrie ergab eine Enthalpieänderung von –25 kcal/mol14. Dieser exotherme Prozess in Verbindung mit einer schwachen Bindungskonstante von 1,0 μM Kd, bestimmt durch Oberflächenplasmonenresonanz, lässt auf einen erheblichen Entropienachteil schließen. Während wir derzeit keine direkten energetischen Messungen für die Extraktion des gp41 TM durch 4E10 im Nanodisc-Kontext haben, zeigen Einzelmolekül-Rasterkraftmikroskopie-Methoden, dass sogar Multi-Pass-Transmembranproteine ​​bei Kräften (pN) entfaltet und aus der Membran extrahiert werden können ) auf dem Niveau oder unter denen, die durch Adhäsionsmoleküle vermittelt werden28. Auch wenn unsere gp145·3Fab-Karte (weitere Beschreibung im Zusatzmaterial) eindeutig eine künstliche Situation darstellt, lässt sie uns zwei Schlussfolgerungen ziehen. Erstens verbleibt im Kontext der Ektodomäne das vom 4E10-bnAb erkannte MPER-Epitop in derselben Konformation, die in der Kristallstruktur des 4E10-Fab im Komplex mit dem MPER-Peptid beobachtet wird (ergänzende Abbildung 7b)26. Zweitens veranschaulicht die vollständige Membranextraktion des Env-Trimers nach der Bindung von drei 4E10-Fabs die Spannung, die die 4E10-Bindung auf die Transmembrandomäne ausübt, was möglicherweise das verzerrte Erscheinungsbild der Nanoscheibe in unserer gp145·1Fab-Karte erklärt (Abb. 3b).

Um die Auswirkung der bnAb-Bindung auf die Env-Dynamik zu verstehen, haben wir die CGMD-Simulationen des membraneingebetteten gp145 analysiert und Schnappschüsse stark geneigter Ektodomänen in atomistische Modelle umgewandelt. In vielen Modellen unterschied sich die Konformation des MPER-C-Segments zu sehr von der in der Kristallstruktur des 4E10-Fab-Komplexes beobachteten, um ein eindeutiges Andocken zu ermöglichen (ergänzende Abbildung 8a). Dieser Befund legt nahe, dass das 4E10-Epitop möglicherweise nur gelegentlich eine optimale Konformation für die Antikörperbindung aufweist. Alternativ oder zusätzlich ist es denkbar, dass anfängliche Wechselwirkungen des Antikörpers nur mit einem Teil seines Epitops erfolgen können, wie zuvor vorgeschlagen13, und dass dies dann die Faltung des gesamten MPER-C-Segments katalysiert, um eine vollständige Interaktion des Fab mit seinem gesamten zu ermöglichen Epitop, wie in der Kristallstruktur zu sehen25,26. Darüber hinaus war das MPER-C-Segment in fast allen Modellen so ausgerichtet, dass das Andocken des 4E10-Fab entweder dazu führte, dass das Fab teilweise in die Membran eingebettet war oder es zu sterischen Konflikten mit der Ektodomäne kam (ergänzende Abbildung 8b). Ein Schnappschuss zeigte jedoch das MPER-C-Segment in einer ähnlichen Ausrichtung wie in unserer gp145·1Fab-Struktur und seine Konformation ermöglichte das Andocken des 4E10-Fab (Abb. 5a). CGMD-Simulationen des membraneingebetteten gp145·1Fab-Komplexes zeigten, dass die Ektodomäne einen ähnlich breiten Winkelbereich annimmt wie ohne den 4E10-Fab (Abb. 5b und Zusatzfilm 4), jedoch mit einem durchschnittlichen Neigungswinkel von 28,7° ± 12,0°, anders als die Ektodomäne ohne Liganden (17,6° ± 10,0°). Darüber hinaus weisen die drei MPER-C-Segmente im gp145 ohne Liganden eine durchschnittliche Neigung von 29, 0 ° ± 20, 7 ° auf (ergänzende Abbildung 9), scheinen sich jedoch unabhängig voneinander zu bewegen (Abb. 5c und ergänzende Abbildung 10). Im Fall von 10E8 Fab-gebundenem gp145 weisen die MPER-C-Segmente ausgeprägtere Winkel auf (Abb. 5d und ergänzende Abb. 11). Der Fab-gebundene MPER-C ist bei einer hohen Neigung von 64,9° ± 10,4° stabilisiert, ähnlich der aus der Kryo-EM-Karte abgeleiteten ~80° (Abb. 4b), während der benachbarte MPER eine mittlere Neigung von annimmt 42,5° ± 15,3°, möglicherweise ausreichend, um die Bindung eines zweiten Fab zu erleichtern, und der letzte MPER nimmt einen niedrigen Neigungswinkel von 20,6° ± 12,7° an, ähnlich dem der MPER-C-Segmente im ligandenfreien gp145.

a Das System aus membraneingebettetem gp145 mit gebundenem 4E10-Fab, das für Simulationen der grobkörnigen Molekulardynamik (CGMD) verwendet wird. Die gp145-Ektodomäne wird in Grau, CHR in Orange, MPER-N in Grün und MPER-C in Magenta dargestellt. Das gebundene Fab ist in Gold und die Lipiddoppelschicht in Gelb dargestellt. b Diagramm, das die Verteilung der Neigungswinkel zeigt, die von der 4E10-Fab-gebundenen gp145-Ektodomäne angenommen werden, und die Daten aus allen fünf Wiederholungen zusammenfasst. Die durchgezogene Linie stellt den Mittelwert dar und das graue Band gibt die Standardabweichung an. Die vertikale Linie bei 29° ist die durchschnittliche Gesamtneigung der Ektodomäne. c Winkel der drei MPER-C-Segmente relativ zur Membranebene, die im Laufe der Zeit in einer der CGMD-Simulationen von gp145 ohne Liganden angenommen wurden und die hochdynamischen und unkorrelierten Bewegungen der drei Segmente veranschaulichen (Daten aus allen Wiederholungen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 10). . d Winkel der drei MPER-C-Segmente, die im Laufe der Zeit in einer der CGMD-Simulationen von 4E10 Fab-gebundenem gp145 übernommen wurden, was verdeutlicht, dass die Fab-Bindung die drei MPER-C-Segmente bei unterschiedlichen Durchschnittswinkeln stabilisiert (Daten von allen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 11). wiederholt).

Unsere Strukturen von in Nanoscheiben eingebettetem gp145 allein und im Komplex mit bis zu drei 4E10-Fabs geben Aufschluss über die Voraussetzungen und Konsequenzen der bnAb-Bindung an den MPER (Abb. 6a). Die meiste Zeit schirmt die hochglykosylierte Env-Ektodomäne das MPER ab, dessen bnAb-Epitop zu einem großen Teil in die Membran eingetaucht ist. Unsere Kryo-EM- und CGMD-Analysen zeigen jedoch, dass die Ektodomäne in Bezug auf die Membran einen weiten Winkelbereich einnehmen kann. Bei einem Neigungswinkel von ~25° (der Winkel, der in der Kryo-EM-Karte von 4E10 Fab-gebundenem gp145 zu sehen ist) oder höher, was ~24 % der Zeit vorkommt (abgeleitet aus den CMGD-Simulationen von unligandiertem gp145), entsteht ein MPER wird der Fab-Bindung zugänglich, was auch und unabhängig davon erfordert, dass das Epitop ausreichend auf der Membran exponiert ist und eine Konformation annimmt, die zumindest anfängliche Bindungswechselwirkungen mit dem Antikörper ermöglicht. Nach der Bindung des Antikörpers an das teilweise exponierte MPER stabilisiert die vollständige Bindung das MPER in einer membranextrahierten Konfiguration und unterbricht dadurch die unabhängigen und vergleichbaren Bewegungen der MPER-Protomere, die ansonsten nachgeschaltete Hemifusions- und Fusionsprozesse erleichtern (siehe unten). Die Überlagerung der epitopgebundenen Fabs anderer MPER-zielender bnAbs mit dem 4E10-Fab, gesteuert durch ihre jeweiligen Epitope, legt nahe, dass dies ein allgemeines Prinzip für die neutralisierende Aktivität dieser bnAbs sein könnte (Abb. 6b). Die Antikörperbindung beeinträchtigt auch die Env-Funktion, indem sie Spannung auf die Transmembrandomänen ausübt. Während unsere Karten die Auswirkung dieser Spannung auf die TM-Domänen nicht offenbaren, deutete eine frühere Studie darauf hin, dass die Antikörperbindung das mutmaßliche helikale Bündel, das von den TM-Domänen gebildet wird, zerstören könnte21. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit der Anti-MPER-bnAbs, nichtligandierte sowie rezeptorgebundene Env-Konfigurationen und den Zwischenzustand vor der Haarnadelkurve zu binden (ergänzende Abbildung 12), ein erweitertes Zeitfenster für die Vermittlung der Virusneutralisierung.

Die gp145-Ektodomäne ist in Grau, CHR in Orange, MPER-N in Grün, MPER-C in Magenta und die Transmembrandomäne in Hellblau dargestellt. Die Lipiddoppelschicht ist hellgelb/braun und der Antikörper hellgelb dargestellt. a In der aufrechten Ausrichtung des Env-Proteins ist das MPER-Epitop für bnAb 4E10 (gekennzeichnet durch *) durch die Ektodomäne verschlossen, wodurch es für den bnAb unzugänglich wird, und ist die meiste Zeit nicht freigelegt, sondern in der Membran vergraben. Das Kippen der Ektodomäne macht das gegnerische MPER vorübergehend zugänglich und wenn dies mit einer zumindest teilweisen Freilegung des Epitops zusammenfällt, kann der bnAb erste Interaktionen eingehen. Die vollständige Antikörperbindung verändert sowohl die MPER-Bewegung auf der Membran als auch eine Belastung der Transmembrandomänen und verhindert so weitere Konformationsänderungen, die für die Membranfusion erforderlich sind. b Strukturelle Ausrichtung von Fabs von MPER-zielenden bnAbs, die an HIV-1-Env gebunden sind. Die Fabs von bnAbs 4E10 (PDB: 4XC3), DH511 (PDB: 5U3N), 10E8 (PDB: 4U6G) und PGZL1 (PDB: 6O3J) wurden basierend auf dem Konsens-MPER-Epitop (Magenta) ausgerichtet, was zeigt, dass alle MPER-C Targeting-bnAbs binden auf ähnliche Weise an HIV-1-Env. Beachten Sie, dass die Lipid-Interaktionsoberfläche von 4E10 hydrophober ist als die der anderen bnAbs26.

Die experimentell beobachteten Kipp- und Drehbewegungen der HIV-1-Trimer-Ektodomäne stimmen mit MD-Simulationen überein. Während Bewegungen für Ektodomänen von Membranrezeptoren erwartet werden können, insbesondere für solche mit Single-Pass-TM-Segmenten, sind uns keine vergleichbaren empirischen Ergebnisse bekannt, die in anderen Systemen berichtet wurden. Eine frühere Kryo-EM-Studie des Env-Proteins in membranmimetischen Umgebungen beobachtete ebenfalls eine Neigung von Fab-gebundenem Env, interpretierte die beobachtete Neigung jedoch hauptsächlich als Ergebnis der Fab-Bindung21. Im Gegensatz dazu ergab eine kürzlich nach Abschluss dieser Arbeit veröffentlichte Kryo-ET-Studie mit nativen HIV-1-Virionen auch, dass Env-Proteine ​​unterschiedliche Neigungswinkel relativ zur Virusmembran annehmen29, was unabhängig voneinander unsere Einzelpartikel-Kryo-EM- und CGMD-Ergebnisse bestätigt Das Env-Protein vollzieht in Abwesenheit eines gebundenen Antikörpers Kippbewegungen. In diesem Zusammenhang ist es denkbar, dass die Koordination des orthogonalen Andockens an gp120 durch den HIV-1-Rezeptor CD4 und seinen Co-Rezeptor (CXCR4 oder CCR5)30, die die für die gp160-vermittelte Fusion erforderliche Konformationsänderung vorbereiten und initiieren,31 eine Herausforderung darstellt durch ektodomäne Gestikulation gemildert.

Allerdings ist es erwähnenswert, dass sich das Trimer bei MD-Simulationen für den Großteil der Analyse in der Nähe der Virusmembran befindet und den Tripod verschließt. Für die Karte mit einer Auflösung von 3,9 Å des in die Nanoscheibe eingebetteten Trimers ohne gebundene 4E10-Fabs wurden weniger als 10 % der angesammelten Einzelpartikel verwendet. Es überrascht nicht, dass die anderen zu heterogen waren, um eine Visualisierung des MPER-Stativs zu ermöglichen, eine Tatsache, die die Annahme unterstreicht, dass der MPER auf der Membran flexibel ist. Diese Ansicht, dass der MPER weitgehend in die Membran eingetaucht ist, steht auch im Einklang mit der Nähe der gp160-Ektodomäne zur Membran, die einen Kriechraum von 10 Å bildet, wie hier (Abb. 1) und in unabhängigen Kryo-ET-Daten29 erwähnt. Diese beiden Ergebnisse stehen im Gegensatz zu denen, die aus einer anderen Kryo-ET-Studie zu HIV-1-BaL-Env-Trimeren auf Aldrithiol-2-inaktivierten Viruspartikeln abgeleitet wurden, in der das MPER eine stielartige Verbindung zwischen der Env-Ektodomäne und der Virusmembran zu bilden scheint32. Die Grundlage für diese Ungleichheit ist derzeit unbekannt.

Frühere NMR-Studien über virale Gruppen hinweg identifizierten ein strukturell konserviertes Paar viraler Lipid-eingebetteter N- und C-Helices, die durch ein Scharnier getrennt sind und deren Tandemgelenke durch die erforderlichen Helix-Capping-Reste verschlossen sind, die aus der Sequenzanalyse von mehr als 20.000 viralen HIV-1-Stämmen identifiziert wurden. Eine Störung beider Gelenke durch Alanin-Substitution dieser Kappen hob sowohl die durch CD4-abhängige als auch CD4-unabhängige Stämme vermittelte Hemifusion und Fusion auf13. Durch die gleichzeitige Abdeckung der Virusmembran mit diesen mobilen hydrophoben MPER-Segmenten ist eine geringere Dehydrierung der Virusmembran erforderlich, um solvatisierte Lipiddoppelschichten physikalisch anzunähern und die Fusion zu vermitteln, wodurch die erforderliche hohe kinetische Barriere verringert wird31,33. Darüber hinaus induziert das MPER-TM-Segment per se die Membrankrümmung und die Lipidmobilität, die auch an der Membranhemifusion und -fusion beteiligt sind33. Diese fusionserleichternden Merkmale des MPER sind angesichts der um eine Größenordnung geringeren Anzahl von Spikes pro HIV-1-Virion im Vergleich zu mehreren anderen Viren, einschließlich Influenza A34, bemerkenswert. Denn die Bindung eines einzelnen Fab beeinflusst nicht nur die Membranoberflächenbewegungen des gebundenen MPER, sondern auch die der anderen beiden Protomere (Abb. 5d und ergänzende Abb. 11) und die Bindung eines Antikörpers oder seines Fab-Fragments scheint ausreichend zu sein, um zu inaktivieren Beim Trimer35 trägt diese Veränderung des MPER wahrscheinlich wesentlich zur Neutralisierung bei.

Angesichts der entscheidenden Rolle des MPER in allen Phasen der HIV-1-Fusion ist die Absicht des Virus, seine Tripod-Struktur vor Angriffen durch Immunantikörper zu schützen, offensichtlich. Während Spike Tilting und möglicherweise CD4-Priming einen vorübergehenden Zugang zu einem Antikörper-Fab-Arm gewähren, ist die Immundominanz anderer viraler Ektodomänenstellen eine wirksame Ablenkungsstrategie, um das MPER-Targeting zu mildern35,36. Unsere früheren MPER-Immunogenitätsstudien ergaben, dass ein auf der Membranoberfläche angeordnetes MPER zwar in vivo immunogen war37, der Annäherungswinkel der meisten durch den Impfstoff hervorgerufenen Antikörper jedoch nicht mit der durch die Ektodomäne auferlegten sterischen Blockade vereinbar ist. Eine zukünftige Impfstoffstrategie besteht darin, die Annäherungswinkel der Antikörper auf diejenigen zu beschränken, die von vorhandenen bnAbs übernommen werden (Abb. 6b), um das native MPER während des Kippens zu binden. Der enorme Unterschied zwischen der Wirksamkeit des Impfstoffs gegen zwei RNA-Viren, nämlich HIV-1 und CoV-2, ist mit einer hohen Mutationsrate und der Dichte der Glykanabschirmung des ersteren gegenüber dem letzteren verbunden38. Ausgehend von den hier dargelegten Überlegungen scheint es daher für die Entwicklung von Schutzimpfstoffen gegen HIV-1 von entscheidender Bedeutung zu sein, auf die am stärksten konservierte und zugänglichste Stelle von HIV-1 abzuzielen.

Das PG9 HRV3C-IgG wurde in FreestyleTM 293-F-Zellen (Thermo Fisher Scientific) exprimiert, die unter Verwendung des FreeStyleTM 293-Expressionsmediums in Suspension kultiviert wurden. Eine 1-L-Kultur von FreestyleTM 293-F-Zellen wurde mit einer 2:1-Mischung (Gew./Gew.) aus HC:LC-PG9-DNA unter Verwendung von PEI „Max“ (Polysciences, Inc.) transfiziert. Nach 6 Tagen wurden die Zellen pelletiert und der Überstand auf eine Protein A-Sepharose-Säule geladen. Das IgG wurde mit 0,5 M Essigsäure eluiert, die Lösung mit 3 M Tris-HCl, pH 9,0, neutralisiert und über Nacht gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 8 mM Na2HPO4 und 2 mM KH2PO4, pH 7,4, 137 mM NaCl) dialysiert. 2,7 mM KCl).

Das 4E10-IgG wurde in ExpiTM 293-F-Zellen (Thermo Fisher Scientific) exprimiert, die unter Verwendung von ExpiTM 293-Expressionsmedium in Suspension kultiviert wurden. Eine 1-L-Kultur von ExpiTM 293-F-Zellen wurde mit einer 1:1-Mischung (Gew./Gew.) aus HC:LC 4E10-DNA unter Verwendung von PEI „Max“ (Polysciences, Inc.) transfiziert. Nach 4 Tagen wurden die Zellen pelletiert und der Überstand auf eine Protein-G-Sepharose-Säule geladen. Das IgG wurde mit 500 mM Essigsäure eluiert, die Lösung mit 3 M Tris-HCl, pH 9,0, neutralisiert und über Nacht gegen PBS dialysiert. Das 4E10-Fab wurde durch 1-stündige Reduktion von 4E10-IgG (15 mg/ml) in 100 mM Dithiothreitol bei 37 °C und anschließende 48-stündige Alkylierung in 2 mM Iodacetamid bei 4 °C hergestellt. Das IgG wurde dann mit Endoproteinase Lys-C (0,01 μg/μL; Roche Applied Sciences) in 25 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA 4 Stunden lang bei 37 °C verdaut. Die Spaltungsreaktion wurde mit 1 mM Nα-p-Tosyl-l-lysin-Chloromethylketon (TLCK) und 0,4 mM Leupeptin gestoppt und die Spaltungsprodukte wurden über eine Protein A-Sepharose-Säule geleitet, um Fc und intaktes IgG zu entfernen.

Die DNA-Sequenz, die für die Reste 1–723 des Env-Proteins des HIV-1-Stammes BG505 kodiert und drei stabilisierende Mutationen (Ala501Cys, Thr605Cys, Ile559Pro), eine eingeführte Glykosylierungsstelle (Thr332Asn) und eine verbesserte Furin-Spaltungsstelle (REKR bis RRRRRR) enthält, und das Furin-Gen wurden einzeln in pEG-BacMam-Expressionsvektoren kloniert. Die Plasmide wurden in Escherichia coli DH10Bac-Zellen transformiert, um Bacmid-DNA zu erzeugen. Rekombinantes Baculovirus wurde durch drei Runden viraler Amplifikation in Spodoptera frugiperda Sf9-Zellen produziert, die in Sf-900III SFM-Medium bei 27 °C kultiviert wurden. Zur Proteinexpression wurden die Baculoviren, die gp145- bzw. Furin-DNA enthielten, in einem Verhältnis von 2:1 (v/v) gemischt und zur Infektion von FreestyleTM 293-F-Zellen in einem Verhältnis von 1:10 (v/v) verwendet. Nach 24 Stunden Infektion wurde den Kulturen Natriumbutyrat in einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt, die Kulturen wurden von 37 °C auf 30 °C gebracht und konnten weitere 48 Stunden lang wachsen. Die Zellen wurden geerntet und in PBS, ergänzt mit 5 mM EDTA und 0,1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (Sigma Aldrich), gewaschen.

Das gp145-Trimer wurde auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle39 mit geringfügigen Modifikationen gereinigt. FreestyleTM 293-F-Zellen, die gp145 exprimierten, wurden mindestens 3 Stunden lang mit PG9-IgG inkubiert, mit PBS gewaschen und mit Lysepuffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 % Triton X-100 und Proteaseinhibitor enthielt, solubilisiert Cocktail (Roche). Nach einstündiger Zentrifugation des Zelllysats bei 38.400 × g und 4 °C wurde der Überstand über Nacht mit Protein A-Harz (GenScript) bei 4 °C inkubiert. Das Harz wurde nacheinander mit 10 Säulenvolumina (CV) Waschpuffer 1 (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03 mg/ml Natriumdesoxycholat, 0,1 % w/v CHAPS) und 10 CV Waschpuffer gewaschen 2 (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,03 mg/ml Natriumdesoxycholat, 0,1 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM)) und 10 CV Waschpuffer 3 ( 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03 mg/ml Natriumdesoxycholat, 0,1 % DDM, 2 mM EDTA). Das an das Protein-A-Harz gebundene PG9-IgG wurde mit 3 C-Protease in Waschpuffer 3, ergänzt mit 80 mM L-Cystein (Sigma Aldrich), 4 Stunden lang bei 4 °C zu Fabs verdaut. Das Eluat wurde zusammen mit einem 5 CV-Waschvorgang mit SEC-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,03 mg/ml Natriumdesoxycholat, 0,05 % DDM) gesammelt. Die Proteinlösung wurde unter Verwendung von Amicon Ultra 15-ml-100-kDa-Cut-off-Zentrifugalfiltern (Millipore Sigma) konzentriert und unter Verwendung von SEC-Puffer über eine Superose 6-Größenausschlusssäule (GE Healthcare) laufen gelassen.

Die in dieser Studie verwendeten Lipide sind polarer Gehirnlipidextrakt, Palmitoyloleylphosphatidylcholin (POPC) und Palmitoyloleylphosphatidylglycerol (POPG), alle gekauft von Avanti Polar Lipids. Die Lipide wurden mit 20 mM Natriumcholat in 30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl unter Ultraschallbehandlung solubilisiert und in einem Molverhältnis von 1,07:1,5:1 gemischt. Zur Rekonstitution in Nanodiscs wurden in DDM gereinigtes gp145, das Gerüstprotein MSP1D1dH5 und die Lipidlösung in einem Molverhältnis von 1:20:300 gemischt. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis wurden 30 % des Probenvolumens mit Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) versetzt, um die Detergenzien zu entfernen. Die Bio-Beads wurden nach 3 Stunden ausgetauscht. Nachdem die Mischung über Nacht bei 4 °C unter konstanter Rotation inkubiert wurde, ließ man die Bio-Beads durch Schwerkraft absetzen und der Überstand, der in Nanoscheiben eingebettetes gp145 enthielt, wurde gesammelt.

In Nanoscheiben eingebettetes gp145 wurde mit 4E10 Fab in einem Molverhältnis von 1:100 mindestens 3 Stunden lang inkubiert. Die Proben wurden unter Verwendung von Amicon Ultra 15-ml-50-kDa-Cut-off-Zentrifugalfiltern (Millipore Sigma) konzentriert und auf eine Superose 6-Größenausschlusssäule geladen, die mit 50 mM HEPES, pH 7,4 und 150 mM NaCl äquilibriert war. Peakfraktionen, die mit 4E10 Fab dekoriertes, in Nanoscheiben eingebettetes gp145 enthielten, wurden gepoolt.

Die Homogenität der Proben wurde zunächst durch Negativfärbungs-EM unter Verwendung von 0,7 % (Gew./Vol.) Uranylformiat wie beschrieben beurteilt40. Um die EM-Durchschnittswerte für Negativfärbungen zu berechnen, wurden 100 Bilder für jede Probe mit einer ladungsgekoppelten Gerätekamera (AMT) XR16L-ActiveVu auf einem Philips CM10-Elektronenmikroskop (Philips) gesammelt, das mit einer Beschleunigungsspannung von 100 kV betrieben wurde. Die kalibrierte Vergrößerung betrug 41.513-fach (nominale Vergrößerung 52.000-fach), was einer Pixelgröße von 2,65 Å auf Probenebene entspricht. Der Defokus wurde auf –1,5 µm eingestellt. Ungefähr 10.000 Partikel wurden für jede Probe manuell mit dem Befehl e2boxer.py des EMAN2-Softwarepakets41 ausgewählt und in 180 × 180-Pixel-Bilder gefenstert. Nach der Bildnormalisierung und Partikelzentrierung wurden die Partikelbilder mithilfe der in SPIDER42 implementierten K-Mittel-Klassifizierungsverfahren in 100 Gruppen klassifiziert.

Der in Nanoscheiben eingebettete gp145–4E10-Fab-Komplex wurde mit BS3 in einem Molverhältnis von 1:600 ​​30 Minuten lang auf Eis vernetzt. Die Vernetzung wurde durch Zugabe von 50 mM Tris, pH 7,5, beendet. Die Probe wurde gegen Puffer mit 50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl dialysiert, um den Vernetzer zu entfernen. Die Homogenität der Probe wurde durch Negativfärbungs-EM untersucht. Für Kryo-EM wurde die Probenkonzentration mit einem NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) gemessen und auf 0,2 mg/ml eingestellt. Aliquots von 4 μl wurden mit einem auf 4° eingestellten Vitrobot Mark VI (Thermo Fisher Scientific) auf leicht leuchtend entladene Graphenoxid (GO)-Gitter (GO auf Quantifoil R1.2/1.3, Cu, 400 Mesh, Electron Microscopy Sciences) aufgetragen C und 100 % Luftfeuchtigkeit. Nach 20 s wurden die Gitter 1 s lang mit einer Blotkraft von –2 geblottet und in mit flüssigem Stickstoff gekühltes Ethan getaucht. Kryo-EM-Datensätze wurden auf einem 300-kV-Titan-Krios-Elektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) gesammelt, das mit einem K2-Summit-Elektronendetektor (Gatan) ausgestattet war, bei einer Nennvergrößerung von ×29.000 im Super-Resolution-Zählmodus. Nach dem Binning über 2 × 2 Pixel betrug die kalibrierte Pixelgröße 1,03 Å auf Probenebene. Belichtungen von 10 s wurden in 40 Bilder (0,25 s pro Bild) mit einer Dosisrate von 8 e–/Pixel/s dosisfraktioniert, was zu einer Gesamtdosis von 80 e–/Å2 führte. Die Daten wurden mit SerialEM43 im „Superfast-Modus“ gesammelt, in dem 3 × 3 Löcher mithilfe von Strahlneigung und Bildverschiebung belichtet werden, bevor der Tisch zur nächsten Position bewegt wird44. Der Defokusbereich wurde auf –1,5 bis –2,5 μm eingestellt. Die Datenerfassungsparameter sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst.

Die 30.404 Filmstapel aus fünf Datenerfassungssitzungen wurden in MotionCorr245 verstärkungsnormalisiert, bewegungskorrigiert, dosisgewichtet und über 2 × 2 Pixel gruppiert. Die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurden mit CTFFIND4 (Lit. 46) geschätzt, das in RELION-347 implementiert ist. Partikel wurden automatisch ohne Vorlagen mit Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/) ausgewählt, in einzelne Bilder extrahiert, normalisiert und in RELION-3 einer 2D-Klassifizierung in 100 Klassen unterzogen. Klassen mit guten 2D-Durchschnittswerten wurden kombiniert und ergaben 3.039.896 Partikel.

Die Identifizierung von Partikeln mit gebundenen 4E10-Fabs wurde durch die Dominanz der Dichte der gp145-Ektodomäne erschwert. Daher wurden nur Partikel aus 2D-Klassen mit klaren Seitenansichten ausgewählt und zur Generierung von vier anfänglichen Modellen mithilfe des Ab-initio-Algorithmus in cryoSPARC v248 verwendet. Die Ab-initio-Rekonstruktion erzeugte eine Karte, die eine klare Dichte einer Ektodomäne mit drei gebundenen 4E10-Fabs zeigte, eine Karte, die eine starke Dichte nur für die Ektodomäne zeigte, und zwei „Junk“-Karten. Die ersten beiden Karten und eine der Junk-Karten wurden als erste Modelle verwendet, um zwei Runden heterogener Verfeinerung in cryoSPARC v2 durchzuführen, was zu einem Stapel von 362.646 Partikeln führte, die eine klare Dichte für drei gebundene 4E10-Fabs zeigten, und 1.878.941 Partikeln, die nur eine klare Dichte zeigten die Ektodomäne.

Die 362.646 Partikel, die eine klare Dichte für drei gebundene 4E10-Fabs zeigten, wurden anschließenden homogenen und ungleichmäßigen Verfeinerungen in cryoSPARC v249 unterzogen, was eine endgültige Karte mit einer globalen Auflösung von 3,66 Å ergab (ergänzende Abbildung 4a).

Die 1.878.941 Partikel, die nur für die Ektodomäne eine klare Dichte aufwiesen, wurden zunächst einer überwachten Klassifizierung in RELION-3 unterzogen, wobei zwei Referenzkarten verwendet wurden, die mit dem Segger-Tool in Chimera aus der Kryo-EM-Karte des in Nanoscheiben eingebetteten HIV-1 voller Länge erstellt wurden Env-Protein vom Stamm AMC011 mit gebundenem PGT151 Fab und 10E8 Fab (EMDB 21332)21. Eine Referenzkarte enthielt nur die Dichte für die Ektodomäne und die Nanoscheibe, während die zweite Referenzkarte auch die Dichte für die 10E8-Fab enthielt. Die 224.730 Partikel, die durch diese Klassifizierung als Fab-gebunden identifiziert wurden, wurden einer weiteren 3D-Klassifizierung unterzogen. Die Dichte für das PG9-Fab, das zur Reinigung verwendet wurde, wurde immer ausgeblendet. Nach einer ersten 3D-Klassifizierung in acht Klassen wurden vier Klassen mit klarer Fab-Dichte kombiniert und einer zweiten Runde der 3D-Klassifizierung in vier Klassen unterzogen. Zwei der resultierenden Klassen zeigten eine Ektodomäne mit einer 4E10-Fab-Bindung. Diese beiden Klassen wurden zusammengefasst und zwei weiteren Runden der 3D-Klassifizierung in vier Klassen unterzogen. Die endgültige Karte mit 23.538 Partikeln wurde durch Nachbearbeitung geschärft, um eine Dichtekarte mit einer globalen Auflösung von 8,8 Å (gp145·1Fab) zu erhalten (ergänzende Abbildung 4a). Eine Klasse der anfänglichen 3D-Klassifizierung in vier Klassen zeigte eine Ektodomäne mit zwei gebundenen 4E10-Fabs. Diese Klasse enthielt 21.454 Partikel und die Karte wurde durch Nachbearbeitung geschärft, um eine Karte mit einer globalen Auflösung von 8,2 Å (gp145·2Fab) zu erhalten (ergänzende Abbildung 4a).

Die verbleibenden 1.654.211 Partikel aus der ersten überwachten Klassifizierung, die keine Dichte für 4E10 Fab zeigten, wurden einer weiteren überwachten Klassifizierung unterzogen, wobei als Referenz zwei Karten von Env mit und ohne Nanoscheibendichte verwendet wurden. Die 1.153.408 Partikel, die eine Dichte für die Nanoscheibe aufwiesen, wurden fünf Runden der 3D-Klassifizierung unterzogen. Bei jedem Klassifizierungsschritt wurden die Klassen mit klarer Dichte sowohl für die Ektodomäne als auch für die Nanoscheibe ausgewählt und einer weiteren Klassifizierung unterzogen. Schließlich wurden 47.616 Partikel aus zwei Klassen mit der besten Dichte im MPER-Bereich kombiniert und verfeinert, gefolgt von einer CTF-Verfeinerung und einem Bayes'schen Polieren50. Die resultierende Dichtekarte wurde durch Nachbearbeitung geschärft, um eine endgültige Karte mit einer globalen Auflösung von 3,9 Å zu erhalten (ergänzende Abbildung 4a).

Der Film, der die verschiedenen Orientierungen veranschaulicht, die die Ektodomäne auf der Nanoscheibenoberfläche annehmen kann, wurde aus experimentellen Karten erstellt. Die Karten wurden aus den aufeinanderfolgenden Runden der 3D-Klassifizierung der 1.654.211 Partikel ausgewählt, die für 4E10 Fab keine Dichte aufweisen. Die Karten wurden auf der Grundlage einer Partikelanzahl von 1000 Partikeln oder weniger (um möglichst viele verschiedene Orientierungen zu identifizieren) sowie einer wohldefinierten Nanoscheibendichte (um die Ausrichtung der Ektodomäne in Bezug auf bestimmen zu können) ausgewählt die Nanoscheibe) (Ergänzende Abbildung 3). Diese Kriterien ergaben 20 Karten, die zur Erstellung des Films in Chimera51 verwendet wurden.

Für gp145 allein wurden die Kristallstruktur der Env-Ektodomäne (Reste 31–662, PDB: 5I8H)52 und die NMR-Struktur des MPER-Peptid-N-Segments (Reste 663–671, PDB: 2PV6)14 manuell an gp145 angedockt Dichtekarte mit dem Befehl „in Karte einpassen“ in Chimera. Nach dem Zusammenführen der Ketten wurde das Modell manuell in Coot53 angepasst und mithilfe von phenix.real_space_refine54 anhand der Dichte verfeinert, wobei die geometrischen und Ramachandran-Beschränkungen durchgehend beibehalten wurden. Nach dem Entfernen der Seitenketten in schlecht definierten Dichtebereichen enthält das endgültige Modell Rückgrat- und Seitenketteninformationen für die Reste 331–662 und nur die Rückgratfaltung für die Reste 663–671.

Für den gp145·3Fab-Komplex wurden die Kristallstrukturen der Env-Ektodomäne (Reste 31–662, PDB: 5I8H)52, die NMR-Struktur des MPER-Peptid-N-Segments (Reste 663–671, PDB: 2PV6)14 und des 4E10 Fab im Komplex mit dem MPER-C-Peptid (Reste 672–684, PDB: 4XC3)26 wurden mithilfe des Befehls „fit in map“ in Chimera manuell in die gp145·3Fab-Dichtekarte angedockt. Nach dem Zusammenführen der Ketten wurde das Modell manuell in Coot angepasst und mithilfe von phenix.real_space_refine anhand der Dichte verfeinert, wobei die geometrischen und Ramachandran-Beschränkungen durchgehend beibehalten wurden. Nach dem Entfernen der Seitenketten in schlecht definierten Dichtebereichen enthält das endgültige Modell Rückgrat- und Seitenketteninformationen für die Reste 31–662 und nur die Rückgratfalte für die Reste 663–684 (mit Ausnahme der Beibehaltung der Seitenketten für Rest 678 in Kette B). und die Reste 664, 671 und 674 in Kette D.

Die Modelle wurden anhand der Halbkarte 1 verfeinert, und dann wurden FSC-Kurven zwischen dem verfeinerten Modell und der Halbkarte 1 (Arbeit), der Halbkarte 2 (frei) und der kombinierten Karte berechnet (ergänzende Abbildung 4c, e).

Für Simulationen von unligandiertem gp145 wurde ein Modell erstellt, indem die Kryo-EM-Struktur der Ektodomäne (diese Studie) mit der NMR-Struktur der MPER-Transmembrandomäne einschließlich der ersten sieben Reste der zytoplasmatischen Domäne (PDB: 6DLN) verknüpft wurde. Das Protein wurde in eine Lipiddoppelschicht bestehend aus POPC und Cholesterin im Molverhältnis 4:1 eingebracht und das System mit dem insane.py-Skript55 in 150 mM NaCl solvatisiert.

Grobkörnige Simulationen wurden mit Martinize2 (https://github.com/marrink-lab/vermouth-martinize) und dem neuesten MARTINI3-Kraftfeldmodell56 erstellt. Die Quartär- und Tertiärstruktur wurde durch die Anwendung eines elastischen Netzwerks auf das CG-Modell mit einer Kraftkonstante von 500 kJ mol−1 nm−2 und oberen und unteren Grenzabständen von 0,9 nm bzw. 0,5 nm beibehalten57. Alle Simulationen wurden mit GROMACS 2020.6 (Ref. 58, 59) durchgeführt und der Leap-Frog-Algorithmus60 wurde verwendet, um Newtonsche Bewegungsgleichungen mit einem Zeitschritt von 20 fs zu integrieren. Simulationen wurden unter Verwendung des Verlet-Cutoff-Schemas für die Nachbarsuche durchgeführt, das alle 20 Schritte aktualisiert wurde61. Elektrostatische Wechselwirkungen wurden mithilfe von Reaction-Field mit einem Coulomb-Grenzabstand von 1,1 nm62 berechnet. Der Geschwindigkeitsrescale-Thermostat wurde verwendet, um die Temperatur bei 310 K63 zu halten. Die Druckkopplung für die Gleichgewichts- und Produktionssimulationen wurde mit dem Berendsen64 bzw. dem Parrinello-Rahman-Barostat65 durchgeführt. Fünf Simulationen, ausgehend von einzigartigen Zufallskeimen, wurden mit jeweils 4,75 ns langen Äquilibrierungsphasen und 10 μs Produktionsläufen durchgeführt.

Für Simulationen von gp145 im Komplex mit 4E10 Fab wurde eine Momentaufnahme einer Simulation von gp145 ohne Liganden erstellt, die eine MPER-C-Konformation zeigte, die der im Kryo-EM-Modell des 4E10 Fab-gebundenen gp145 ähnelt. Dieser grobkörnige Schnappschuss wurde mit dem Skript „backward.py“66 und dem CHARMM-GUI All-Atom-Konverter67 in eine Ansicht aller Atome konvertiert. Das resultierende atomistische Modell wurde verwendet, um die Struktur des 4E10-Fab (PDB: 4XC3) anzudocken, gesteuert durch das Fab-gebundene MPER-C-Peptid, mit geringfügigen Anpassungen, um sterische Konflikte mit der gp145-Ektodomäne zu vermeiden. Das Protein wurde in eine Lipiddoppelschicht bestehend aus POPC und Cholesterin im Molverhältnis 4:1 eingebracht und das System mit dem insane.py-Skript in 150 mM NaCl solvatisiert.

Grobkörnige Simulationen wurden wie für gp145 ohne Liganden beschrieben erstellt und durchgeführt. Es wurde ein elastisches Netzwerk mit den gleichen Parametern wie oben beschrieben angewendet. Zwischen dem 4E10-Fab und dem MPER-C-Segment wurden auch elastische Netzwerkinteraktionen angewendet, um Bindungsinteraktionen aufrechtzuerhalten. Fünf Simulationen, ausgehend von einzigartigen Zufallskeimen, wurden mit 6,75 ns langen Äquilibrierungsphasen und jeweils 1 μs Produktionsläufen durchgeführt.

Simulationstrajektorien wurden mit gmx trjconv zentriert. Der gmx-Gangle wurde verwendet, um die Winkel der gp145-Ektodomäne und der MPER-C-Segmente zu messen. Die Flugbahnen wurden mit VMD v.1.9.4a12 (Ref. 68) visualisiert und Diagramme mit Microsoft Excel erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Kryo-EM-Karten wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter den Zugangscodes EMD-25022 (gp145), EMD-25024 (gp145•1Fab), EMD-25025 (gp145•2Fab) und EMD-25045 hinterlegt ( gp145•3Fab). Die Atomkoordinaten wurden in der Proteindatenbank (PDB) unter den Zugangscodes 7SC5 (gp145) und PDB-7SD3 (gp145·3Fab) hinterlegt. Zuvor berichtete verwendete PDB-Zugangscodes lauten wie folgt: 1TZG (4E10 Fab/MPER), 2PV6 (MPER-Peptid-N-Segment, NMR); 4U6G (10E8 Fab/MPER); 4XC3 (4E10 Fab/MPER-C-Peptid); 5I8H (Env-Ektodomäne); 5U3N (DH511 Fab/MPER); 6DLN (MPER-Stativ); 6E8W (MPER-Stiel-Blase); 6O3J (PGZL1 Fab/MPER). Zuvor berichtete verwendete EMDB-Zugangscodes lauten wie folgt: EMDB-21332 (AMC011 mit gebundenem PGT151 Fab und 10E8 Fab) und EMDB-21334 (AMC011 mit gebundenem 10E8 Fab).

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Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Shuang Yang, Giorgos Hiotis.

Labor für molekulare Elektronenmikroskopie, Rockefeller University, New York, NY, USA

Shuang Yang, George Hiotis & Thomas Walz

Tri-institutionelles PhD-Programm in chemischer Biologie, The Rockefeller University, New York, NY, USA

Giorgos Hiotis

Labor für Immunbiologie, Abteilung für Medizinische Onkologie, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Yi Wang, Junjian Chen, Jia-huai Wang, Mikyung Kim & Ellis L. Reinherz

Medizinische Fakultät, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Yi Wang, Junjian Chen & Ellis L. Reinherz

Abteilung für biologische Chemie und molekulare Pharmakologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Jia-huai Wang

Abteilung für Krebsbiologie, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Jia-huai Wang

Abteilung für Pädiatrie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Jia-huai Wang

Abteilung für Dermatologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Mikyung Kim

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ELR und TW haben die Studie konzipiert. SY, GH, MK, ELR und TW haben die Experimente entworfen. SY, YW und JC stellten Antikörper-Fabs her. SY führte alle biochemischen und strukturbiologischen Experimente durch. GH führte alle molekulardynamischen Experimente durch. JHW, MK, ELR und TW überwachten Experimente. Alle Autoren analysierten die Ergebnisse. SY, ELR und TW haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Ellis L. Reinherz oder Thomas Walz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Tyler Reddy und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, S., Hiotis, G., Wang, Y. et al. Die dynamische Bewegung des HIV-1-Spikes macht sein membrangebundenes Stativ anfällig für Antikörperangriffe. Nat Commun 13, 6393 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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Eingegangen: 09. Mai 2022

Angenommen: 06. Oktober 2022

Veröffentlicht: 27. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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