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Jan 07, 2024

Die Substratbindung im mitochondrialen ADP/ATP-Träger ist ein Schritt

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3585 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mitochondriale ADP/ATP-Träger importieren ADP in die mitochondriale Matrix und exportieren ATP in das Zytosol, um zelluläre Prozesse anzutreiben. Strukturen der gehemmten zytoplasmatischen und Matrix-offenen Zustände haben einen alternierenden Zugangstransportmechanismus bestätigt, die molekularen Details der Substratbindung sind jedoch noch ungeklärt. Hier bewerten wir die Rolle der lösungsmittelexponierten Reste des Translokationswegs im Prozess der Substratbindung. Wir identifizieren die Hauptbindungsstelle, bestehend aus drei positiv geladenen und einer Reihe aliphatischer und aromatischer Reste, die ADP und ATP in beiden Zuständen binden. Darüber hinaus gibt es auf gegenüberliegenden Seiten dieser Stelle zwei Paare von Asparagin-/Argininresten, die zustandsabhängig an der Substratbindung beteiligt sind. Somit werden die Substrate durch eine Reihe von Bindungspositionen geleitet, wodurch die Konformationsänderungen des Trägers induziert werden, die zu ihrer Translokation führen. Die Eigenschaften dieser Stelle erklären die elektrogene und reversible Natur des Adeninnukleotidtransports.

Die Lebensfähigkeit und Funktion eukaryontischer Zellen beruht auf dem Transport von Metaboliten und Ionen durch die undurchlässige mitochondriale Innenmembran, um die Stoffwechselwege des Mitochondriums und des Zytosols aufrechtzuerhalten und Verbindungen für die Organellen- und Zellerhaltung bereitzustellen. Der Großteil dieser Verbindungen wird von der mitochondrialen Trägerfamilie (SLC25) transportiert, der größten Familie gelöster Träger beim Menschen1,2,3. Der mitochondriale ADP/ATP-Träger, auch Adeninnukleotid-Translokase genannt, führt einen der produktivsten Transportschritte im menschlichen Körper durch. Der Träger importiert zytosolisches ADP in die mitochondriale Matrix zur Umwandlung in ATP durch die ATP-Synthase und exportiert ATP in den Intermembranraum, der mit dem Zytoplasma zusammenfließt, um als integralen Bestandteil die energieverbrauchenden Prozesse der Zelle anzutreiben oxidative Phosphorylierung4. Der Träger wechselt zwischen zwei Zuständen, die üblicherweise als Matrix-offener Zustand und zytoplasmatisch-offener Zustand bezeichnet werden, da die Substratbindungsstelle auf diese Kompartimente ausgerichtet ist5,6. Funktionelle und strukturelle Studien wurden durch die Verfügbarkeit zustandsspezifischer Inhibitoren unterstützt. Der Träger wird durch Atractylosid (ATR)7 und Carboxyatractylosid (CATR)8,9 in einem zytoplasmatisch offenen Zustand fixiert, wohingegen er durch Bongkrekinsäure (BKA)10,11,12 in einem Matrix-offenen Zustand fixiert wird. Beide inhibitorgebundenen Zustände sind fehlgeschlagen, da die Hemmung durch die Verhinderung der Substratbindung und durch das Einfangen des Trägers in einer Strukturkonformation erreicht wird, die nicht Teil des Transportzyklus ist5,6.

Wie die meisten SLC25-Mitglieder besteht der ADP/ATP-Träger aus drei homologen Sequenzwiederholungen von jeweils etwa 100 Aminosäuren13, die sich zu einer dreifachen pseudosymmetrischen Struktur mit einem zentralen Translokationsweg für die Substrate falten14. Die atomare Struktur des bovinen ADP/ATP-Trägers im CATR-gebundenen zytoplasmatisch-offenen Zustand zeigte, dass jede Sequenzwiederholung eine Domäne kodiert, die aus einer ungeradzahligen Transmembran-α-Helix (H1, H3, H5) und einer Schleife mit einem Kurzschluss besteht Helix (h12, h34, h56), die auf der Matrixseite parallel zur Membran verläuft, und eine geradzahlige Transmembran-α-Helix (H2, H4, H6)15 (Ergänzende Abbildung 1). Diese grundlegende Topologie wurde durch die atomaren Strukturen der pilzlichen ADP/ATP-Träger bestätigt, die im CATR-gebundenen zytoplasmatisch-offenen Zustand16 und im BKA-gebundenen Matrix-offenen Zustand17 eingeschlossen sind.

In jeder der drei Domänen bilden die ungeradzahlige Helix, die Matrixhelix und der N-terminale Teil der geraden Helix bis zum „Kontaktpunkt“17,18,19 das Kernelement, während der C-terminale Teil Ein Teil der geradzahligen Helix bildet das Torelement 17 (Ergänzende Abbildung 1). Die gegenseitige Umwandlung zwischen den beiden Zuständen erfolgt abwechselnd20 und beinhaltet umfangreiche Bewegungen der sechs Strukturelemente, was den ADP/ATP-Träger zum dynamischsten Transporter gelöster Stoffe macht, der bisher identifiziert wurde5,17. Die drei Torelemente öffnen und schließen die zytoplasmatische Seite des Trägers, während die drei Kernelemente abwechselnd die Matrixseite schließen und öffnen. Das Öffnen und Schließen wird durch die Störung und Bildung von zwei Salzbrückennetzwerken und -klammern reguliert: dem Matrix-Salzbrückennetzwerk des [PS]x[DE]xx[KR]-Motivs15,16 und der Glutaminklammer16 auf den Kernelementen und dem Zytoplasma Salzbrückennetzwerk des [FY][DE]xx[RK]-Motivs17,20,21 und Tyrosinklammern17 auf den Gate-Elementen (Ergänzende Abbildung 1). Die koordinierte Bewegung dieser sechs Strukturelemente wird durch die Substratbindung und -freisetzung als einzige direkte Energiequelle angetrieben22,23.

Im Transportzyklus sind Substratbindung und Konformationsänderungen voneinander abhängige Prozesse, was bedeutet, dass es eine kontinuierliche Reihe hochdynamischer substratgebundener Zustände geben muss: vom zytoplasmatisch-offenen Zustand über einen verschlossenen Zustand bis zum Matrix-offenen Zustand zurück. Während dieses Prozesses können die ADP- und ATP-Moleküle viele verschiedene Konformere annehmen, da der Träger zwischen verschiedenen Konformationen wechselt. Daher ist es notwendig, diesen komplexen Prozess zu entwirren, bevor wir ihn durch direkte Strukturanalysen angehen können.

Biochemische Studien, die vor der Verfügbarkeit von Strukturen durchgeführt wurden und nicht transportierbare Nukleotidanaloga verwendeten, ließen Substratbindungsstellen in den Matrixschleifen24,25,26,27 und der C-terminalen Region27 vermuten. Spätere Sequenzanalysen, die chemische Einschränkungen und Abstandsbeschränkungen18,19 oder Abweichungen von der Pseudosymmetrie20 als Konzepte verwendeten, deuteten auf eine Stelle im zentralen Teil des Hohlraums hin, die drei „Kontaktpunkte“18,19 umfasste (ergänzende Abbildung 1). . Im Gegensatz dazu zeigten Molekulardynamiksimulationen Substratwechselwirkungen im gesamten Translokationsweg28,29,30,31. Offensichtlich haben die verschiedenen Studien keinen Konsens für die Position der Substratbindungsstelle ergeben, und daher wird ihre experimentelle Bestimmung ein wesentlicher erster Schritt zur Lösung der Schlüsselprobleme der Substratbindung und der Konformationskopplung des mitochondrialen ADP/ATP-Trägers sein.

Hier bieten wir die direkte experimentelle Identifizierung der an der Substratbindung beteiligten Reste durch die Kombination von Funktionstests mit Bindungsstudien unter Verwendung von Alanin-Ersatzmutanten des Substrattranslokationswegs (Abb. 1). Unser Ansatz identifiziert alle Reste, die mit den Substraten interagieren, unabhängig vom Konformationszustand. Die Identifizierung der Bindungsstellenreste liefert den Rahmen zur Aufklärung wichtiger molekularer Details des Bindungs- und Transportmechanismus. Wichtig ist, dass die an der ADP- und ATP-Bindung beteiligten Reste dieselben sind, was die vollständig reversible elektrogene Natur des Transports erklärt.

a Membranansicht des Homologiemodells von TtAac im zytoplasmatisch-offenen Zustand (links) und der experimentell bestimmten Struktur von TtAac im Matrix-offenen Zustand (rechts) (PDB-Code: 6gci-Kette A). Die in dieser Studie analysierten Rückstände sind als gelbe Stäbchen dargestellt, während die Rückstände der Matrix und der zytoplasmatischen Netzwerke als schwarze Stäbchen dargestellt sind, wobei ionische Wechselwirkungen als magentafarbene Striche dargestellt sind. Die durch HOLE59 ermittelten wasserzugänglichen Flächen sind in transparentem Blau dargestellt. b Reste der Transmembranhelices, die den in dieser Studie analysierten Translokationsweg säumen, sind blau markiert und die Reste der Salzbrückennetzwerke schwarz.

Um Rückstände zu identifizieren, die an der Substratbindung beteiligt sein könnten, analysierten wir die wasserzugänglichen Rückstände im mitochondrialen ADP/ATP-Träger des Pilzes Thermothelomyces thermophila (TtAac), der in Detergenzien stabiler ist als die Hefeorthologe32. Um alle Kandidatenreste zu identifizieren, verwendeten wir die experimentell bestimmte Matrix-offene Struktur von TtAac17 und ein vergleichendes Homologiemodell des zytoplasmatisch-offenen Zustands, basierend auf den aufgelösten Strukturen des zytoplasmatisch-offenen Zustands (PDB-Einträge 1okc, 4c9h, 4c9q und 4c9j). ). Insgesamt wurden 36 Reste im Translokationsweg identifiziert, die alle lösungsmittelzugänglichen Reste umfassen, mit Ausnahme der beiden Salzbrückennetzwerke, die unabhängig von der Substratspezifität universell konserviert sind und eine definierte Rolle im Mechanismus spielen15,16, 17,20,21 (Abb. 1). Jeder der ausgewählten Reste wurde durch Alanin ersetzt, wodurch ein Satz von 36 Varianten entstand.

Zunächst führten wir funktionelle Komplementationsstudien mit dem transportdefizienten WB-12-Stamm von Saccharomyces cerevisiae33 durch. Die Expression von Wildtyp-TtAac stellte das Wachstum von WB-12 vollständig wieder her (100 % Komplementierung), während die Kontrolle, die einen leeren Vektor enthielt, kein Wachstum zeigte (ergänzende Abbildung 2). Von den 36 Alanin-Varianten ergänzten nur fünf das Wachstum in ähnlichem Ausmaß wie der Wildtyp, während 19 überhaupt kein Wachstum zeigten (<3 %) und weitere 12 ein deutlich reduziertes Wachstum zeigten (im Bereich von 18 bis 76 %) (Abb. 2a). , Ergänzende Abbildung 2). Die 19 für die Funktion wesentlichen Reste sind im gesamten zentralen Hohlraum verteilt (Abb. 2b) und unter den ADP / ATP-Trägerorthologen hoch konserviert (ergänzende Abb. 3). Es wurde bereits gezeigt, dass die geladenen Reste K30, R88, R197, R246 und R287 für das Wachstum und die Transportaktivität in anderen Orthologen wichtig sind34,35,36,37,38,39. Diese Daten zeigten, dass die meisten Reste im Translokationsweg für einen effizienten ADP/ATP-Austausch wichtig sind.

a Prozentsatz der funktionellen Komplementierung des WB-12-Stamms, der TtAac-Varianten exprimiert, im Vergleich zur Expression des Wildtyp-Trägers (100 % Komplementierung), bestimmt durch Densitometrie von seriellen Verdünnungs-Spot-Tests auf YPG-Medium (ergänzende Abbildung 2). Die Balken und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von vier unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanzanalyse wurde mit zweiseitigen t-Tests bei einer Stichprobe durchgeführt, wie in „Methoden“ beschrieben (p > 0,05, ns; p ≤ 0,05, *; p ≤ 0,01, **; p ≤ 0,001, ***; p ≤ 0,0001, ****). Die Farben stellen die drei beobachteten Wachstumseigenschaften dar: Wachstum nicht wesentlich beeinträchtigt (ns), hellblau; Wachstum deutlich beeinträchtigt (0,5 ≥ p > 0,0001), marine; kein Wachstum (p ≤ 0,0001), dunkelblau. b Position der analysierten Reste in der Matrix-offenen BKA-gebundenen TtAac-Struktur (PDB-Code: 6gci-Kette A), dargestellt als Cartoon-Darstellung. Kugeln stellen die CA-Kohlenstoffatome dar und sind wie in a beschrieben farblich gekennzeichnet. Die Quelldaten für diese Abbildung werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Komplementationstests können nicht bestimmen, welcher Aspekt der Struktur oder Funktion von der Mutation betroffen ist. Die geringe Bindungsaffinität der Substrate (μM-Bereich23), ein entscheidender Aspekt des Transportmechanismus, schließt die Verwendung von Bindungstests aus. Da Komplementierungstests keine spezifisch an der Substratbindung beteiligten Reste identifizieren können, verwendeten wir einen Thermostabilitätsverschiebungstest, der die Entfaltung einer Proteinpopulation mit der Thiol-reaktiven Sonde 7-Diethylamino-3-(4-maleimidophenyl)-4-methylcumarin überwacht ( CPM) in einer Temperaturrampe40. An dem Punkt, an dem die Entfaltungsrate maximal ist, kann eine scheinbare Schmelztemperatur (Tm) als Parameter der Thermostabilität32 ermittelt werden. Der CPM-Assay kann verwendet werden, um den Faltungszustand und die Stabilität von Membranproteinen unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten32,41,42. Darüber hinaus liefern Verschiebungen in den Thermostabilitätsprofilen Informationen über die Bindung von Inhibitoren17,21,32,43 und anderen Effektoren44. Kürzlich wurde gezeigt, dass es auch bei der Bindung von Substraten an Transportproteine ​​zu Verschiebungen kommen kann32,45, da spezifische Wechselwirkungen zwischen den Protein- und Substratmolekülen entstehen45. Im Prinzip würde eine Störung dieser Wechselwirkungen durch Mutationen zu einer Verringerung der substratinduzierten Thermostabilitätsverschiebung führen und eine Möglichkeit bieten, Reste zu identifizieren, die direkt an der Substratbindung beteiligt sind.

Zur Durchführung der Thermostabilitätsverschiebungsexperimente verwendeten wir gereinigte Proteine, die im Hefestamm W303-1B exprimiert wurden und die Überexpression aller 36 Varianten unabhängig von ihrer funktionellen Aktivität ermöglichten. Alle Varianten wurden in ähnlichem Ausmaß exprimiert und waren korrekt auf die Mitochondrien ausgerichtet. Sie wurden erfolgreich durch Nickel-Affinitätsbindung und Affinitäts-Tag-Spaltung auf der Säule gereinigt (ergänzende Abbildung 4). Ihr Faltungszustand und ihre strukturelle Integrität wurden mit CPM-Assays in Gegenwart und Abwesenheit der spezifischen Inhibitoren CATR und BKA17,21,32 bewertet (Abb. 3). Die Stabilität der meisten Mutanten wurde durch die einzelnen Mutationen nicht beeinträchtigt, da sich ihre scheinbare Tm nicht signifikant vom Wildtyp (50,2 ± 0,6 °C) unterschied (48,2–52,8 °C) (Abb. 3a). Ausnahmen bildeten die Varianten L41A, Q44A, T146A, Y239A und N284A, die sich in einem entfalteten Zustand befanden, gemessen an der hohen anfänglichen Fluoreszenz und dem Fehlen einer sigmoidalen Entfaltungskurve (ergänzende Abbildung 5a). Bemerkenswerterweise befinden sich alle diese Reste im Matrix-Gate (ergänzende Abbildung 5b, c). Das Matrix-Gate stellt eine Isolationsschicht dar, die den Verlust der Protonenantriebskraft durch Protonenleck verhindert, wenn sich der Träger im zytoplasmatisch offenen Zustand befindet17. Darüber hinaus ist der Rest Q44 die Glutaminklammer zwischen H1 und H516.

a CPM-Thermostabilitätsdaten jedes Proteins in Abwesenheit von Effektoren (oben) oder in Anwesenheit von CATR (Mitte) oder BKA (unten). Die Balken und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die Stichprobenstandardabweichung von acht unabhängigen Experimenten für den Wildtyp und 2–7 für die Varianten dar. Die Signifikanzanalyse für jede Bedingung wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, wie unter „Methoden“ beschrieben. Es werden nur die Signifikanten angegeben (p > 0,01, ns; p ≤ 0,01, *; p ≤ 0,001, **; p ≤ 0,0001, ***; p ≤ 0,00001, ****). b Seitenansicht der zytoplasmatisch-offenen Zustandsstruktur von ScAac2 im Komplex mit CATR (PDB-Code: 4c9h-Kette A). Die interagierenden Reste von ScAac2 sind in TtAac konserviert, mit Ausnahme von K104, das in TtAac R100 ist, und die beiden Proteine ​​​​haben eine Sequenzidentität von 74 %. Um den Vergleich zu erleichtern, haben wir die TtAac-Markierung verwendet (ergänzende Abbildung 3). Rückstände, die ionische Wechselwirkungen (gelbe Striche) und hydrophobe Kontakte mit CATR (Marine) eingehen, sind in Dunkelblau bzw. Braun dargestellt. Der Rest K104 von ScAac2 wurde für TtAac zu Arg (R100) modelliert. c Matrixansicht der Matrix-offenen Struktur von TtAac mit gebundenem BKA (PDB-Code: 6gci-Kette A). Reste, die ionische Wechselwirkungen (gelbe Striche) oder Wasserstoffbrückenbindungen (schwarze Striche) mit BKA (orange) eingehen, sind in Lila dargestellt, während Reste, die hydrophobe Kontakte bilden, in Cyan dargestellt sind. Die Quelldaten für diese Abbildung werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wichtig ist, dass alle 31 gefalteten Varianten, ausgehend vom Zustand ohne Liganden, beide Inhibitoren binden konnten, wie aus den Verschiebungen zu höheren scheinbaren Tm-Werten hervorgeht, was bestätigt, dass die Träger ohne Liganden gefaltet waren. Nur wenn der mutierte Rest an spezifischen Wechselwirkungen mit dem Inhibitor teilnimmt, wird eine Verringerung oder Aufhebung der thermischen Verschiebung beobachtet. Auf diese Weise war es möglich, die Bindungsstellen der Inhibitoren zu kartieren (Abb. 3b, c), die gut mit den meisten beobachteten Wechselwirkungen in den Strukturen der CATR- und BKA-gebundenen Zustände übereinstimmten15,16,17. Die Übereinstimmung ist bemerkenswert, da die Thermostabilitätsdaten mit Trägern in Lösung bei Temperaturen im Bereich von 25–90 °C gemessen werden, während Kristallstrukturen in flüssigem Stickstoff bei −196 °C bestimmt werden. Einige offensichtliche Unstimmigkeiten erfordern weitere Kommentare. Die Rinderstruktur15 zeigt, dass die äquivalenten Reste von K30 und R246 über geordnetes Wasser mit CATR interagieren, was mit den verringerten Verschiebungen übereinstimmt, die für die relevanten Alaninvarianten beobachtet wurden (Abb. 3b). Die Reste L135 und V138 könnten Van-der-Waals-Kontakte mit der isovalerischen Gruppe von CATR bilden. Im Fall von BKA zeigten die Mutanten F97A, R100A, N123A, Y204A und L295A eine deutlich verringerte Verschiebung, obwohl diese Reste nicht direkt an der Bindung beteiligt sind. Sie sind Teil der Tyrosinklammern und des hydrophoben Pfropfens des Matrix-offenen Zustands17 und daher entscheidend für dessen Bildung, eine Voraussetzung für die Bindung von BKA. Eine ähnliche Beobachtung wurde für die Reste gemacht, aus denen das zytoplasmatische Netzwerk besteht21. Insgesamt lieferte die Inhibitoranalyse den prinzipiellen Beweis dafür, dass dieser Assay zum Nachweis von Rückständen verwendet werden kann, die an Protein-Ligand-Wechselwirkungen beteiligt sind. Darüber hinaus bewiesen die Thermostabilitätsdaten insgesamt, dass bis auf fünf Varianten (ergänzende Abbildung 5) alle Proteine ​​ohne Liganden gut gefaltet und für Substratbindungsanalysen geeignet waren.

Anschließend haben wir einen geeigneten Konzentrationsbereich bestimmt, um die substratinduzierten Thermostabilitätsverschiebungen unter Verwendung der ligandenfreien Träger zu charakterisieren. Die Verschiebungen wurden als ΔTm-Wert ausgedrückt, der durch Subtrahieren der scheinbaren, proteinspezifischen Tm in Abwesenheit von Substrat von der scheinbaren Tm bei jeder Substratkonzentration berechnet wurde. In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten45 stiegen die ΔTm-Werte des Wildtyps konzentrationsabhängig bis zur Sättigung bei 12 mM (ΔTm = 8,9 ± 1,8 °C) (ergänzende Abbildung 6). Basierend auf diesem Titrationsexperiment wurden fünf repräsentative Konzentrationen von ADP und ATP (0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM) ausgewählt, um die Reaktion der Varianten zu testen. Wir weisen darauf hin, dass diese Messungen keine kinetische Beurteilung ermöglichen, da die Ein- und Ausschaltraten des Substrats mit steigenden Temperaturen zunehmen und die Proteinentfaltung und -markierung irreversibel ist. Das Plateau entsteht, weil die Substratbindung die Entfaltung bei diesen erhöhten Temperaturen nicht verhindern kann.

Anschließend haben wir die Thermostabilitätsverschiebungen in Gegenwart von ADP und ATP für alle 31 gefalteten Varianten gemessen. Hinsichtlich ihrer Reaktion auf Substrat wurden sie in drei Klassen eingeteilt (Abb. 4, 5). In der ersten Klasse zeigten die Varianten K30A, R88A, R197A, R246A und R287A keine konzentrationsabhängige Thermostabilitätsverschiebung in Gegenwart eines der beiden Substrate (Abb. 4a), was darauf hinweist, dass jeder dieser Reste eine kritische Wechselwirkung mit dem Substrat eingeht. Die Varianten zeigten durchweg kein Wachstum in Komplementationstests (Abb. 2a, ergänzende Abb. 2). Diese positiv geladenen Reste befinden sich in der Mitte des wassergefüllten Hohlraums (Abb. 4c) und ihr Alaninaustausch führt zum Verlust einer positiven Ladung.

a, b Thermostabilitätsverschiebungswerte (ΔTm), bestimmt bei 0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM Substratkonzentration für den Wildtyp und einzelne Alanin-Ersatzvarianten. Kreise und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von acht unabhängigen Experimenten für den Wildtyp und 3–7 für die Varianten dar. Leere und ausgefüllte Kreise stehen für ADP bzw. ATP. Daten für das Wildtyp-Protein werden in Schwarz angezeigt, während diejenigen für die Varianten in Rot (a) bzw. in Orange (b) für die kritischen bzw. wichtigen Reste angezeigt werden. Beachten Sie, dass für mehrere Datenpunkte der Mittelwert und die Fehlerbalken der ADP- und ATP-Gruppen identisch sind und ihre grafische Darstellung daher überlagert ist, mit der ADP-Markierung oben. Fehlerbalken werden manchmal durch das Symbol verdeckt. Signifikante Unterschiede wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit Interaktion bewertet, wie unter „Methoden“ beschrieben. Signifikante Werte (p ≤ 0,01) werden für ADP bzw. ATP mit * oder # gekennzeichnet. c TtAac-Matrix-offene BKA-gebundene Struktur (PDB-Code: 6gci-Kette A) (links) und Nahaufnahme (rechts), die die analysierten Reste in roten oder orangefarbenen Stäbchen und Kugeln für Gly-Darstellungen zeigt. Helices werden in Weizen-Cartoon-Darstellung dargestellt und sind beschriftet. Die Quelldaten für diese Abbildung werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

a, b Thermostabilitätsverschiebungswerte (ΔTm), bestimmt bei 0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM Substratkonzentration für den Wildtyp und einzelne Alanin-Ersatzvarianten. Kreise und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von acht unabhängigen Experimenten für den Wildtyp und 3–5 für die Varianten dar. Leere und ausgefüllte Kreise stehen für ADP bzw. ATP. Daten für das Wildtyp-Protein werden in Schwarz angezeigt, während die Variantendaten in Grün angezeigt werden. Beachten Sie, dass in mehreren Fällen der Mittelwert und die Fehlerbalken der ADP- und ATP-Gruppen identisch sind und ihre grafische Darstellung daher überlagert ist, mit der ADP-Markierung oben. Fehlerbalken sind kleiner als das Symbol, wenn sie nicht angezeigt werden. Die statistische Auswertung erfolgte wie unter „Methoden“ beschrieben. Signifikante Werte (p ≤ 0,01) werden für ADP bzw. ATP mit * oder # gekennzeichnet. c TtAac-Matrix-offene BKA-gebundene Struktur (PDB-Code: 6gci-Kette A) (links) und Nahaufnahme (rechts), die die analysierten Reste in grünem Stab und Kugel für Gly-Darstellungen zeigt. Helices werden in Weizen-Cartoon-Darstellung dargestellt und sind beschriftet. Die Quelldaten für diese Abbildung werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die zweite Klasse von Alanin-Ersatzvarianten umfasste sechs Reste (N85, N96, L135, V138, G192 und Y196), die sich in der Nähe der fünf kritischen Reste befanden und im Vergleich zum Wildtyp deutlich veränderte Thermostabilitätsprofile aufwiesen (Abb. 4b). ). Diese Varianten zeigten zwar konzentrationsabhängige Verschiebungen in Gegenwart des Substrats, diese waren jedoch deutlich geringer als die des Wildtyp-Proteins. Signifikante Unterschiede wurden hauptsächlich für die beiden höchsten getesteten Konzentrationen festgestellt, sowohl für ADP als auch für ATP (Abb. 4b). Da die substratinduzierten Verschiebungen nicht vollständig aufgehoben wurden, leistet jeder Rest einen Beitrag zur Substratbindung. Als Beleg für ihre beitragende Rolle wuchsen die Varianten L135A, G192A und Y196A in der Komplementationsstudie überhaupt nicht (<3 %), wohingegen N85A, N96A und V138A deutlich weniger wuchsen (42 ± 23 %, 18 ± 10 % und 53 ±). 14%) (Abb. 2a, ergänzende Abb. 2). Bemerkenswert ist, dass der Alaninersatz bei keiner der elf Varianten in diesen beiden Klassen zu Proteininstabilität oder Störung der Bindungstasche (Abb. 3) führte, was unterstreicht, dass die beobachteten Effekte tatsächlich spezifisch für die Substratbindung sind.

Wichtig ist, dass die dritte Klasse von Varianten 20 der 31 Varianten umfasste, die substratinduzierte Verschiebungen aufwiesen, die sich nicht signifikant von denen des Wildtyp-Proteins unterschieden (Abb. 5). Die Thermostabilitätsverschiebungen der mutierten Proteine ​​S29A, V230A, G288A und G291A unterschieden sich bei keiner ADP- und ATP-Konzentration vom Wildtyp (Abb. 5a), und diese Varianten waren voll funktionsfähig (Abb. 2a, ergänzende Abb. 2). Obwohl die Varianten F97A, S189A, Y204, G235A und L295A das Wachstum nicht ergänzten und T92A, Q93A, R100A, S134, Y200A, T231A und S238A nur teilweise ergänzten (Abb. 2a, ergänzende Abb. 2), wiesen sie alle ähnliche Thermostabilitätsverschiebungen auf wie das Wildtyp-Protein in Gegenwart von Substraten (Abb. 5a). Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Mutationen wichtige Schritte des Transportmechanismus beeinflussten, nicht jedoch die Substratbindung.

Vier Varianten zeigten einige Unterschiede zum Wildtyp, jedoch nicht konsistent. Die Variante Y89A konnte das Wachstum teilweise ergänzen (36 ± 19 %) (Abb. 2a), zeigte jedoch für beide Nukleotide größere Verschiebungen als der Wildtyp (signifikant nur für ADP) (Abb. 5b), was darauf hinweist, dass dieser Rest nicht direkt daran beteiligt ist Substratbindung. Die Variante N123A war teilweise aktiv (50 ± 9 %) (Abb. 2a) und die substratinduzierten Verschiebungen unterschieden sich nur bei 5 mM signifikant vom Wildtyp (Abb. 5b). Der Stamm, der die Variante V294 exprimierte, wuchs auf Glycerin auf Wildtyp-Niveaus (84 ± 14 %) (Abb. 2a) und das gereinigte Protein war stabiler (53,7 ± 0,5 °C) als der Wildtyp (50,2 ± 0,6 °C) ( Abb. 3a). Dies führte bei niedrigen Substratkonzentrationen zu einer falschen Signifikanz, erreichte jedoch bei der höchsten ATP-Konzentration Wildtyp-Werte (Abb. 5b). Schließlich war die Stabilität des mutierten Proteins I193A sehr unterschiedlich (Abb. 5b, 3a), was eine Beurteilung der Bedeutung der substratinduzierten Verschiebungen ausschloss.

Reste, die nicht an der Substratbindung beteiligt sind, befanden sich im gesamten Translokationsweg, aber auch in unmittelbarer Nähe derjenigen, die nachweislich an der Substratbindung beteiligt waren (Abb. 5c). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Tests zur Thermostabilitätsverschiebung einzelne an Protein-Substrat-Wechselwirkungen beteiligte Reste genau identifizieren können und dass die Substratbindung auf eine Gruppe von Resten im Translokationsweg beschränkt ist. Bemerkenswerterweise gab es bei allen getesteten Proteinen keine signifikanten Unterschiede zwischen den durch ADP oder ATP induzierten thermischen Verschiebungen bei irgendeiner Substratkonzentration (ergänzende Abbildung 7).

Die mitochondrialen ADP/ATP-Träger verfügen über einzigartige Eigenschaften, die es ihnen ermöglichen, einen hohen ADP- und ATP-Fluss durch die mitochondriale Innenmembran zu erreichen, um unsere täglichen Aktivitäten aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus haben sie sich weiterentwickelt, um die Herausforderung des Imports von negativ geladenem ADP gegen das große elektrochemische Potenzial zu meistern, das von der Atmungskette über die innere Mitochondrienmembran erzeugt wird. Obwohl er seit mehr als 55 Jahren erforscht wird, gibt es immer noch viele offene Fragen zum Transportmechanismus, insbesondere zur Substratbindung und ihrer Auswirkung auf die gegenseitige Umwandlung zwischen dem Matrix- und dem zytoplasmatisch-offenen Zustand.

Für den Ort der Substratbindungsstelle wurden viele Vorschläge gemacht19,20,24,25,26,27,28,29,30,31, aber hier gehen wir dieser Frage experimentell mit den relevanten Substraten nach. Unser Ansatz ermöglicht eine vollständige Bewertung des Substratbindungsprozesses und hebt nur signifikante Wechselwirkungen hervor. Nachdem wir alle Reste des Translokationswegs zwischen den beiden Salzbrückennetzwerken untersucht haben, haben wir diejenigen identifiziert, die eine entscheidende und beitragende Rolle bei der Substratbindung spielen, und haben gezeigt, dass sie sich etwa auf halber Strecke des Translokationswegs zusammenballen. Die Beobachtung, dass eine einzelne Mutation die Bindung vollständig aufheben kann, deutet darauf hin, dass es an anderer Stelle keine anderen signifikanten Substratbindungsstellen gibt, wie etwa in den Matrixschleifen oder in der C-terminalen Region, wie zuvor behauptet24,25,26,27. Es ist möglich, dass andere beobachtete Wechselwirkungen28,29,30,31 vorübergehender Natur sind, einschließlich derjenigen der „Tyrosinleiter“15,28, für die wir keine experimentelle Bestätigung finden. Da sich außerdem die durch ADP und ATP induzierten Thermostabilitätsverschiebungen bei keiner Konzentration der getesteten Proteine ​​statistisch voneinander unterschieden (ergänzende Abbildung 7), müssen beide Substrate auf ähnliche Weise an denselben Satz von Resten binden (Abb . 6). Da ADP/ATP-Träger als Monomere fungieren14,17,46,47,48,49,50, müssen die Import- und Exportschritte daher aufeinander folgen, was einen kinetischen Ping-Pong-Mechanismus impliziert.

Seitenansichten von der Membran des zytoplasmatisch offenen Zustands (links) (ScAac2, PDB-Code 4c9h-Kette A) und des Matrix-offenen Zustands (PDB-Code 6gci-Kette A) (rechts) des mitochondrialen ADP/ATP-Trägers. Die interagierenden Reste von ScAac2 sind in TtAac konserviert. Um den Vergleich zu erleichtern, haben wir die TtAac-Markierung verwendet (ergänzende Abbildung 3). Die durch HOLE59 ermittelten wasserzugänglichen Flächen sind in transparentem Blau dargestellt. Rückstände des wassergefüllten Hohlraums, die eine entscheidende und wichtige Rolle bei der Substratbindung spielen, sind in Rot bzw. Orange dargestellt, während die Substrate ADP und ATP in Grün bzw. Cyan dargestellt sind. Die wasserzugänglichen Flächen sind blau dargestellt.

Bei den positiv geladenen Resten K30, R88, R197, R246 und R287 führten einzelne Alaninaustausche zum Funktionsverlust (Abb. 2a) und zur vollständigen Aufhebung der substratbedingten Thermostabilitätsverschiebungen (Abb. 4a). Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften können diese Reste ionische Wechselwirkungen mit den negativ geladenen Phosphatgruppen der Nukleotide eingehen. Auf diese Weise leisten sie relativ große Beiträge zur gesamten Wechselwirkungsenergie der Substratbindung, was die für den Transport erforderlichen Konformationsänderungen erleichtert22,23. Andererseits führte der Alaninersatz der Reste N85, N96, L135, V138, G192 und Y196 zu einem teilweisen oder vollständigen Funktionsverlust (Abb. 2a) und zu deutlich verringerten Thermostabilitätsverschiebungen in Gegenwart von Substraten (Abb. 4b). Angesichts der chemischen Eigenschaften und relativen Positionen dieser Reste ist es wahrscheinlich, dass sie gemeinsam an der Bindung der relativ hydrophoben Adenosineinheit beteiligt sind und schwächere Wechselwirkungen als die oben genannten geladenen Reste bilden, dh hydrophobe und aromatische Stapelwechselwirkungen. Somit leisten sie kleinere individuelle Beiträge zur gesamten Wechselwirkungsenergie der Substratbindung.

Frühere Sequenzanalysen, die die chemischen Eigenschaften von Substraten und Abstandsbeschränkungen berücksichtigten, legten nahe, dass an der Substratbindung drei „Kontaktpunkte“ beteiligt sind, die für alle Mitglieder der SLC25-Familie universell sind und auf den geradzahligen Transmembranhelices zu finden sind18. 19. Später wurde entdeckt, dass sie auch Gelenkpunkte zwischen den Kern- und den Gate-Elementen der Proteindomänen bilden und so die Substratbindung mit einem gemeinsamen Transportmechanismus verbinden4,5,17. Die in dieser Studie identifizierten kritischen Reste R88 und R287 auf H2 bzw. H6 entsprechen den Kontaktpunkten I und III. Der kritische Rest K30 auf H1 befindet sich dazwischen auf gleicher Höhe im zentralen Hohlraum. Reste, die einen wichtigen Beitrag zur Bindung leisten, G192 und Y196 auf H4, befinden sich am Kontaktpunkt II, während L135 und V138 in der Nähe liegen. Alle diese sieben Reste sind in beiden Konformationszuständen zugänglich und haben ähnliche Konformere (Abb. 6), was zeigt, dass sie gemeinsam an der Substratbindung beteiligt sind und während der Konformationsänderungen die Hauptsubstratbindungsstelle bilden. Die zentrale Lage dieser Stelle steht im Einklang mit der Bildung und Zerstörung der Matrix und der zytoplasmatischen Tore auf beiden Seiten, wenn der Träger zwischen den Zuständen wechselt4,5,17. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es der Dreh- und Angelpunkt aller Konformationsänderungen ist, die während des Transportzyklus auftreten17.

Die verbleibenden vier Reste bilden zwei Asparagin/Arginin-Paare, N85/R246 und N96/R197, die sich auf gegenüberliegenden Seiten der Hauptstelle befinden. Sie haben die gleichen chemischen Eigenschaften und könnten daher ähnliche Rollen erfüllen. Der Vergleich der zytoplasmatischen und Matrix-offenen Strukturen zeigt deutlich, dass diese Asn/Arg-Paare die Konformere zustandsabhängig ändern (Abb. 6). Im zytoplasmatisch offenen Zustand zeigen die Reste N96/R197 in Richtung der Öffnung des Hohlraums, während sie im Matrix-offenen Zustand Teil der Hauptbindungsstelle sind. Umgekehrt zeigen die Reste N85/R246 im Matrix-offenen Zustand zur Öffnung des Hohlraums, während sie im zytoplasmatisch offenen Zustand Teil der Hauptbindungsstelle sind (Abb. 6). Da diese Paare auf die Öffnung des Hohlraums zeigen, sind sie wahrscheinlich für die anfängliche Bindung und endgültige Freisetzung der Nukleotide verantwortlich.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es eine einzige Bindungsstelle für die Adenosineinheit und mehrere positiv geladene und polare Reste zur Bindung der Phosphateinheiten gibt, die zustandsabhängig oder zustandsunabhängig ineinandergreifen, was auf einen schrittweisen Prozess hinweist. Ihre Rolle im Transportzyklus kann durch einen schrittweisen Mechanismus erklärt werden, der unser aktuelles Modell der Substratbindungsereignisse darstellt. Zunächst dringt ADP im zytoplasmatischen Zustand durch Brownsche Bewegung und elektrostatische Anziehung in den Hohlraum des Trägers ein28,29,30 und die Phosphateinheiten greifen in das N96/R197-Paar ein (Abb. 7a). Sobald die hydrophobe Adenineinheit von ADP gebunden ist, kann sie sich zur Substraterkennung an die hydrophobe/aromatische Bindungsstelle (G192, Y196, L135 und V138) binden und sie so von der Wasserphase abschirmen (Abb. 7b)18,19,51. Dies ist ein wichtiger Schritt, da mitochondriale ADP/ATP-Träger eine enge Spezifität haben und nur ADP, ATP und deren Desoxyvarianten transportieren30,51. Als nächstes binden die negativ geladenen Phosphateinheiten an die positiv geladenen K30, R88 und R287 der Hauptbindungsstelle, positionieren das ADP-Molekül im zentralen Bereich und neutralisieren seine Ladung (Abb. 7c). Alle Kontaktpunkte der Bindungsstelle sind jetzt aktiviert und ermöglichen den Übergang zu den nächsten Stufen. Das terminale Phosphat von ADP beginnt mit dem N85/R246-Paar in Kontakt zu treten (Abb. 7d) und setzt die Konformationsänderungen in den verschlossenen (Abb. 7e) und Matrix-offenen Zustand (Abb. 7f) fort. Eine ähnliche, aber nicht identische Pose wie in Abb. 7d wurde in MD-Simulationen beobachtet28,30, aber die Simulationszeiten (<1 μs) waren zu kurz für den Abschluss des Halbzyklus (~0,5 ms). Schließlich bringt das N85/R246-Paar ADP näher an die Mündung der Höhle und gibt es zur ATP-Synthese in die mitochondriale Matrix ab (Abb. 7f). Das neu synthetisierte ATP wird vom Träger in einer ähnlichen Reihe von Wechselwirkungen und Konformationsänderungen aus dem Mitochondrium transportiert,4,5,17, jedoch in umgekehrter Reihenfolge (Abb. 7g-l).

Verschiedene Phasen des Transportzyklus: a–d, l zytoplasmatisch offener Zustand, e, k verschlossener Zustand und f–j Matrix-offener Zustand. Die Substrate ADP und ATP haben eine Adenin-Einheit (grün bzw. cyan), eine Ribose-Einheit (gelb) und zwei bzw. drei Phosphat-Einheiten (orange). Die Adenosin-Bindungsstelle wird durch eine Hufeisenform dargestellt, wohingegen positiv geladene und polare Reste der Bindungsstelle in Blau bzw. Grün dargestellt sind. Die schwarzen Pfeilspitzen zeigen die Substratbewegungen, die die Umwandlung zwischen Zuständen induzieren, während die roten Pfeilspitzen den Ein- und Austritt der Substrate anzeigen.

Auf diese Weise werden die großen und konformativ unterschiedlichen ADP- und ATP-Moleküle durch eine Reihe von Konformeren geleitet, die mit den komplexen Konformationsänderungen einhergehen, die für ihre Translokation erforderlich sind. Darüber hinaus deutet die Position der zentralen Stelle mit den beiden Asn/Arg-Paaren auf beiden Seiten darauf hin, dass die Substrate unabhängig von der Richtung, aus der sie kamen, einer ähnlichen Reihe von Wechselwirkungen ausgesetzt sind, was die beobachtete reversible Natur des Transports erklärt. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen wird die Transportrichtung nicht durch die Proteineigenschaften, sondern durch die chemischen Gradienten der Substrate und das Membranpotential bestimmt.

Darüber hinaus können die elektrostatischen Eigenschaften der identifizierten Bindungsreste einen wichtigen Aspekt der Bioenergetik des Adeninnukleotidtransports in Mitochondrien erklären. Beim Import von ADP werden drei negative Ladungen gegen das Membranpotential bewegt, während beim Export von ATP vier negative Ladungen mitbewegt werden. Die Ladungsbewegungen wurden direkt unter Verwendung von Käfignukleotiden gemessen und ergaben Werte von +0,3 oder +0,5 für den ADP-Importschritt und –0,7 oder –0,5 für den ATP-Exportschritt52,53. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde vorgeschlagen, dass die Substratbindungsstelle 3,3 oder 3,5 positive Gegenladungen enthalten sollte52,53. Diese Messungen stimmen gut mit den drei positiven Ladungen von K30, R88 und R287 in der Hauptbindungsstelle überein, die sich mit dem Substrat in das andere Kompartiment umorientieren, wenn der Träger seine Konformation ändert. Die Teilladungen könnten auf die zustandsabhängigen Wechselwirkungen von R197 oder R246 zurückzuführen sein, die vorübergehender und schwächerer Natur sind. Die Teilladungen stimulieren sowohl den Import von ADP als auch den Export von ATP bei Vorhandensein eines großen Membranpotentials und minimieren die elektrophoretische Kraft auf die gebundenen Substrate im okkludierten Zustand. Der beobachtete äquimolare Austausch von ADP und ATP wird nicht durch die Eigenschaften der Substratbindungsstelle bestimmt, sondern durch die beiden Salzbrückennetzwerke, die die Konformationsänderungen in Abwesenheit von Substrat verhindern. Nur die Bindung des Substrats führt zu einer Konformationsänderung, da sie einen Energieeintrag zum Aufbrechen des Netzwerks liefert22,23 und somit ein eins-zu-eins-Austausch der beiden Substrate stattfindet.

Interessanterweise waren die Varianten K30A, R88A und R287A aufgrund der Entfernung thermostabiler (57,3 ± 1,2, 53,1 ± 1, 64,4 ± 0,2 °C) als der Wildtyp-Träger (50,2 ± 0,6 °C) (Abb. 3). einer der positiven Ladungen, die im zentralen Hohlraum dicht beieinander liegen. Somit könnte verhindert werden, dass sich der Träger in Abwesenheit von Substraten zwischen Zuständen umwandelt, da durch die Abstoßung dieser drei positiven Ladungen beim Konformationswechsel des Trägers eine hohe Energiebarriere entsteht. Die Bindung des negativ geladenen ADP und ATP an diese Reste würde die freie Energie senken, indem sie sie neutralisieren, was zu einer Substrattranslokation führt. Die G291A- und V294A-Mutationen, die sich auf interhelikale Reste17 auswirken, können die Dynamik behindern, wohingegen R100A, das einem Tyrosin-Klammer entspricht17, das zytoplasmatische Netzwerk schwächen kann, wodurch der zytoplasmatisch-offene Zustand stochastisch wahrscheinlicher wird. Somit machen diese Mutationen auch die gegenseitige Umwandlung von Zuständen ungünstiger, was zu stabileren Varianten führt (Abb. 3).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Eigenschaften der identifizierten Bindungsstelle viele Merkmale des Mechanismus erklären, für die es bisher keine molekulare Erklärung gab. Die gleichen hier entdeckten Prinzipien könnten für die Bindung und den Transport von Substraten für andere Mitglieder der mitochondrialen Trägerfamilie SLC25 gelten, die derzeit untersucht werden.

Gegenstand der Studie war der mitochondriale ADP/ATP-Träger von Thermothelomyces thermophila. Zur Expression des mitochondrialen Wildtyp-ADP/ATP-Trägers wurde das Gen codonoptimiert und in einen pYES3/CT-Derivatvektor (Carlsbad, CA, Invitrogen, USA) kloniert, der den konstitutiv aktiven pPIC2-Promotor des Phosphatträgers pic2 von enthielt Saccharomyces cerevisiae21,46. Einzelne Alanin-Ersetzungen wurden an den angegebenen Positionen für jede Variante eingeführt, indem das relevante Codon durch GCT (das häufigste Codon für Alanin im Hefegenom) unter Verwendung von Overlap-Extension-PCR54 mit KOD HotStart-Polymerase (Novagen) ersetzt wurde. Die Primer zur Einführung der Mutationen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die Expressionsplasmide wurden in die S. cerevisiae-Stämme WB-12 (MATα ade2-1 trp1-1 ura3-1 can1-100 aac1::LEU2 aac2::HIS3) transformiert. 33, bei dem die Gene aac1 und aac2 gestört sind und im Stamm W303-1B (MATα leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15) unter Verwendung der LiAc/SS-Träger-DNA/ PEG-Methode55. Erfolgreiche Transformanten wurden auf Platten mit synthetischem vollständigem Tryptophan-Dropout-Medium (Formedium), ergänzt mit 2 % (w/v) Glucose, selektiert. Als Kontrolle wurde ein leerer Vektor verwendet, der durch Wiederherstellung der mehrfachen Klonierungsstelle des Vektors erzeugt wurde.

Der WB-12-Stamm, der die Wildtyp- oder Mutantenproteine ​​oder den leeren Vektor exprimiert, wurde über Nacht in synthetischem, vollständigem Tryptophan-Dropout-Medium, ergänzt mit 2 % (w/v) Glucose, gezüchtet. Die Zellen wurden dreimal mit ultrareinem sterilem Wasser gewaschen, sodass die Glucose vollständig entfernt und auf eine OD600 von 1 verdünnt wurde. Es wurden vier Reihenverdünnungen (1:10) hergestellt und 3,5 μl der Ausgangskultur und jede Verdünnung auf a verteilt YPG-Platte hinzufügen und 72 Stunden bei 30 °C inkubieren. Für die Analyse wurden nur die zweite und dritte Verdünnung verwendet. Jede Platte enthielt die Wildtyp- und leere Vektorkontrolle. Das Wachstum der Wildtyp- und Alanin-Ersatzmutanten wurde durch Densitometrie quantifiziert. Gescannte Bilder oder Fotos der Platten wurden mit der Fiji-Software (Version 2.3.0/1.53q)56, insbesondere dem Tool „Gel Analysis“, analysiert. Die Dichte der Kolonien (gesamte Oberfläche) wurde gemessen und als Prozentsatz der Dichte des Wildtyps derselben Platte und Verdünnung ausgedrückt, nachdem die Dichte des leeren Vektors von beiden abgezogen wurde. Die aus der zweiten und dritten Verdünnung (10–2, 10–3) berechneten Wachstumsprozentsätze wurden gemittelt und dieser Wert stellte eine biologische Wiederholung dar. Die Experimente wurden unabhängig voneinander viermal wiederholt.

Für jedes Wildtyp- und Variantenprotein wurde eine 1-l-Vorkultur des Expressionsstamms verwendet, um 10 l YPG-Medium plus 0,1 % (Gew./Vol.) Glucose in einem autoklavierbaren 15-l-Biobündel von Applikon mit eZ zu beimpfen Kontrolle. Als genetischer Hintergrund für den Wildtyp wurde entweder der Stamm WB-12 oder der Stamm W303-1B verwendet, da keine Unterschiede in der Ausbeute, Stabilität oder Aktivität des aus beiden Stämmen gereinigten Trägers beobachtet wurden. Für die Varianten wurde der Stamm W303-1B ausgewählt, da dieser Stamm unabhängig vom Funktionszustand des mutierten Proteins eine ausreichende Expression ermöglichte. Die Zellen wurden unter Verwendung einer DYNO-MILL (Willy A. Bachofen) lysiert und Mitochondrien isoliert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –70 ° C gelagert.

Isolierte Hefemitochondrien (~350 mg Gesamtprotein) wurden durch Resuspension in einem Puffer gelöst, der 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 % (v/v) Glycerin, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol pH 7,5 und einen vollständig EDTA-freien Puffer enthielt Proteaseinhibitor-Cocktailtablette (Roche) und 1 % (Gew./Vol.) Dodecyl-β-maltosid (Glycon Biochemicals GmbH), gefolgt von sanftem Rühren bei 4 °C für 1 Stunde. Partikelmaterial wurde durch Ultrazentrifugation (235.000 × g, 45 min, 4 °C) entfernt und die lösliche Fraktion wurde mit zuvor gewaschenen und äquilibrierten (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) Nickel-Sepharose-Perlen (GE Healthcare) inkubiert 2 h, bei 4 °C, unter leichtem Rühren. Ungebundene Proteine ​​wurden durch Zentrifugation (200 × g, 5 min, 4 °C) entfernt und die gebundene Fraktion in eine leere Säule (BioRad) gegeben, wo sie mit 40 Säulenvolumina Puffer A (20 mM HEPES-NaOH pH) gewaschen wurde 7,5, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol pH 7,5, 0,1 % (w/v) Dodecyl-β-maltosid, 0,1 mg/ml Tetraoleoyl-Cardiolipin), gefolgt von 25 Säulenvolumina Puffer B (20 mM HEPES-NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % (w/v) Dodecyl-β-maltosid, 0,1 mg/ml Tetraoleoylcardiolipin). Das Säulenmaterial wurde dann mit 500 μl Puffer B resuspendiert und mit 5 mM CaCl2 und 10 μg Faktor Für die Varianten N123A, G192A, I193A, R197A und R246A wurde der Verdauungsschritt auf der Säule aufgrund der Proteininstabilität im Laufe der Zeit mit 30 μg Faktor-Xa-Protease auf 2 Stunden verkürzt. Nach der Behandlung mit Faktor Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Spektrophotometer (NanoDrop Technologies) bei 280 nm oder dem Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassay-Kit (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Für die Tests zur CPM-Thermostabilitätsverschiebung wurde frisch gereinigtes Protein verwendet.

Die Bewertung der Stabilität der Proteinpopulation für den Wildtyp und Varianten in Gegenwart und Abwesenheit von Effektoren (Substraten oder Inhibitoren) erfolgte mittels thermischer Entfaltung, die durch einen Temperaturanstieg induziert wurde32. In diesem Assay werden zunächst unzugängliche Cysteinreste durch thermische Denaturierung dem Lösungsmittel ausgesetzt und reagieren mit dem Fluorophor N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-cumarinyl)phenyl]-maleimid (CPM)40. Die Reaktion führt zur Bildung fluoreszierender Addukte, die mithilfe eines rotierenden quantitativen PCR-Geräts (qPCR) (Rotor Gene Q, Qiagen) überwacht wird. Für jedes Experiment wurden 5 mg/ml CPM-Stammlösung in Dimethylsulfoxid auf 0,1 mg/ml in Reinigungspuffer B (20 mM HEPES-NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % (w/v) Dodecyl-β-maltosid) verdünnt , 0,1 mg/ml Tetraoleoylcardiolipin) und wurde im Dunkeln für 10 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert. Drei Mikrogramm gereinigtes Protein wurden mit dem relevanten Effektor (sofern angegeben) gemischt und in Puffer B auf ein Endvolumen von 45 μl verdünnt, zu dem 5 μl CPM-Lösung von 0,1 mg/ml hinzugefügt wurden. Die Effektoren ADP und ATP wurden in Endkonzentrationen von 0,1, 0,5, 1, 5 und 10 mM, CATR in 20 μM und BKA in 20 μM plus 5 μM ADP hinzugefügt, das hinzugefügt wurde, um den Trägern zu ermöglichen, der Reihe nach zwischen den Zuständen zu wechseln um den Inhibitor21 zu binden. Die Mischung wurde sehr kurz verwirbelt und 10 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C inkubiert, bevor sie in das qPCR-Gerät gegeben wurde. Anschließend wurde die Proteinpopulation in einem Temperaturgradienten von 25 bis 90 °C untersucht, was einer Geschwindigkeit von ~4 °C pro Minute entspricht. Die zunehmende Fluoreszenz des Protein-Fluorophor-Addukts wurde im HRM-Kanal der Maschine gemessen (Anregung bei 440–480 nm und Emission bei 505–515 nm). Entfaltungsprofile wurden mit der Rotor-Gene Q-Software 2.3 analysiert, wobei der Wendepunkt der Entfaltungskurven verwendet wurde, um die scheinbare Schmelztemperatur (Tm) der Proteine ​​unter den verschiedenen getesteten Bedingungen zu bestimmen. Ein ΔTm-Wert wurde erhalten, indem die Tm des Proteins in Abwesenheit von Effektoren von der Tm bei jeder Konzentration der Effektoren subtrahiert wurde.

Das Modell von TtAac im zytoplasmatisch offenen Zustand wurde mit Modeller Version 9.2258 erstellt, wobei die strukturbasierten Ausrichtungen der Ketten A der PDB-Codes 1okc, 4c9h, 4c9q und 4c9j und die Einschränkungen verwendet wurden, dass die Reste 140 bis 156 wie in helikal sein sollten die Matrix-offene Zustandsstruktur von TtAac, PDB-Code: 6gci. Zur Überprüfung der Modelle wurde die DOPE-Bewertung verwendet. Der Zusammenstoßwert wurde durch Energieminimierung der Struktur in Chimera verbessert. Nach der Untersuchung der Bindungsstellenreste hatte K30 im Vergleich zum äquivalenten Rest in 4c9h seine Position verschoben und befand sich wieder im ursprünglichen Konformer. Schließlich wurden die N- und C-Termini gekürzt, um die Struktur in 4c9h widerzuspiegeln. Die wasserzugänglichen Flächen wurden von HOLE59 ermittelt.

Die Ergebnisse in allen Abbildungen sind als Mittelwert ± Standardabweichung der angegebenen Anzahl von Experimenten dargestellt. Die statistische Analyse der Daten wurde mit GraphPad Prism Version 9.2.0 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA) wie unten beschrieben durchgeführt. In den Komplementationsexperimenten wurden Wachstumsunterschiede durch einen zweiseitigen T-Test mit einer Stichprobe analysiert, wobei der Wachstumsprozentsatz der Varianten mit dem mittleren prozentualen Wachstum des Wildtyps verglichen wurde. Unterschiede zwischen den variantenspezifischen Tm-Werten und dem Wildtyp-Tm-Wert wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA bewertet, gefolgt von einem Dunnett-Post-hoc-Test zur Korrektur mehrerer Vergleiche. Unterschiede zwischen den variantenspezifischen Tm-Werten und dem Wildtyp-Tm in Gegenwart von Inhibitoren (CATR und BKA) wurden auf die gleiche Weise bewertet (einfaktorielle ANOVA, gefolgt von einem Dunnett-Post-hoc-Test). Bezüglich der thermischen Verschiebungen, die durch das Substrat (ADP oder ATP) bei Proteinvarianten hervorgerufen werden, wurden die Unterschiede zwischen den Gruppen durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit Interaktion für jede getestete Nukleotidkonzentration bewertet. Einfache Effekte zwischen Proteinvarianten innerhalb der Substratebene wurden mithilfe des Dunnet-Post-hoc-Tests gegen das Wildtyp-Protein analysiert und korrigiert (dargestellt in Abb. 4, 5). Einfache Effekte zwischen Substraten für jeden Proteingehalt wurden analysiert und durch den Sidak-Post-hoc-Test korrigiert (visualisiert für 10 mM in der ergänzenden Abbildung 7). Unterschiede wurden auf dem 1 %-Niveau als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Alle in dieser Studie generierten Komplementierungs- und Thermostabilitätsverschiebungsdaten wurden in der Mendeley-Datenbank unter dem Zugangscode https://doi.org/10.17632/mrhnw45w5y.1 (https://data.mendeley.com/datasets/mrhnw45w5y/1) hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir möchten Dr. Gonçalo C. Pereira für seine Ratschläge zu den statistischen Analysen und Dr. Chancievan Thangaratnarajah für die Erstellung des leeren pYES3/CT-Derivatvektors danken, der in den Komplementationsstudien verwendet wurde. Diese Arbeit wurde durch den Medical Research Council Grant MC_UU_00028/2 an ERSK unterstützt.

Mitochondriale Biologieeinheit des Medical Research Council, Universität Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, Keith Peters Building, Hills Road, Cambridge, CB2 0XY, Großbritannien

Vasiliki Mavridou, Martin S. King, Sotiria Tavoulari, Jonathan J. Ruprecht, Shane M. Palmer und Edmund RS Kunji

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VM, MSK, ST und ERSK entwarfen die Forschung, SMP führte die groß angelegten Fermentationen durch, VM und MSK führten die molekularbiologischen und mitochondrialen Vorbereitungen durch, VM reinigte die Proteine ​​und führte biophysikalische Analysen durch, VM und ERSK analysierten die Daten, VM, JJR und ERSK haben die Zahlen vorbereitet, VM, MSK, ST, JJR und ERSK haben das Papier verfasst

Korrespondenz mit Edmund RS Kunji.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mavridou, V., King, MS, Tavoulari, S. et al. Die Substratbindung im mitochondrialen ADP/ATP-Träger ist ein schrittweiser Prozess, der die strukturellen Veränderungen im Transportzyklus steuert. Nat Commun 13, 3585 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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Eingegangen: 20. Dezember 2021

Angenommen: 14. Juni 2022

Veröffentlicht: 23. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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