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Aug 07, 2023

Die kompensatorische Epistase erhält die ACE2-Affinität bei SARS aufrecht

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7011 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Omicron BA.1-Variante erschien Ende 2021 und verbreitete sich schnell auf der ganzen Welt. Im Vergleich zu den früheren SARS-CoV-2-Varianten weist BA.1 viele Mutationen auf, von denen einige bekanntermaßen das Entweichen von Antikörpern ermöglichen. Viele dieser Antikörper-Escape-Mutationen verringern einzeln die Affinität der Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) für ACE2, aber BA.1 bindet ACE2 immer noch mit hoher Affinität. Die Fitness und Entwicklung der BA.1-Linie wird daher durch die kombinierten Auswirkungen zahlreicher Mutationen vorangetrieben. Hier kartieren wir systematisch die epistatischen Wechselwirkungen zwischen den 15 Mutationen in der RBD von BA.1 im Vergleich zum Wuhan Hu-1-Stamm. Insbesondere messen wir die ACE2-Affinität aller möglichen Kombinationen dieser 15 Mutationen (215 = 32.768 Genotypen) und umfassen alle möglichen evolutionären Zwischenprodukte vom angestammten Wuhan-Hu-1-Stamm bis zu BA.1. Wir stellen fest, dass Immun-Escape-Mutationen in BA.1 einzeln die ACE2-Affinität verringern, aber durch epistatische Wechselwirkungen mit anderen affinitätsverstärkenden Mutationen, einschließlich Q498R und N501Y, kompensiert werden. Daher hängt die Fähigkeit von BA.1, der Immunität zu entgehen und gleichzeitig die ACE2-Affinität aufrechtzuerhalten, vom Erwerb mehrerer interagierender Mutationen ab. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kompensatorische Epistase ein Schlüsselfaktor für wesentliche evolutionäre Veränderungen bei SARS-CoV-2 ist und stimmen mit der Entstehung von Omicron BA.1 durch eine chronische Infektion überein.

Die Omicron BA.1-Variante von SARS-CoV-2 trat im November 2021 auf und verbreitete sich rasch auf der ganzen Welt, was zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückzuführen ist, der bestehenden Immunität bei geimpften und zuvor infizierten Personen zu entkommen1,2. Bemerkenswerterweise ging Omicron nicht als Nachkomme der damals weit verbreiteten Delta-Linie hervor. Stattdessen erschien es als stark divergenter Stamm, nachdem sich Dutzende Mutationen innerhalb einer Abstammungslinie angesammelt hatten, die zu diesem Zeitpunkt noch nicht weit verbreitet war, darunter 15 Mutationen innerhalb der Spike-Protein-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD)1.

Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass eine Reihe dieser 15 RBD-Mutationen (von denen einige in anderen Varianten vorkommen) die Bindung spezifischer monoklonaler Antikörper3,4,5,6,7 stören und möglicherweise zur Immunflucht beitragen. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass die meisten dieser Mutationen die Bindungsaffinität an menschliches ACE2 verringern, wenn sie innerhalb der Wuhan Hu-1-, Delta- oder mehreren anderen SARS-CoV-2-Linien auftreten8,9, was möglicherweise den Viruseintritt in Wirtszellen beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu toleriert das Omicron RBD diese Escape-Mutationen und behält gleichzeitig eine starke Affinität zu ACE210,11, was darauf hindeutet, dass andere Mutationen in dieser Linie dazu beitragen könnten, den Viruseintritt aufrechtzuerhalten.

Frühere Arbeiten haben die Auswirkungen von Mutationen auf die Antikörperbindung und die ACE2-Affinität systematisch analysiert, beispielsweise mithilfe von Deep Mutational Scanning (DMS)9,12. Allerdings konzentrieren sich diese Ansätze auf die Auswirkungen einzelner Mutationen auf bestimmte genetische Hintergründe. Sie sind daher nützlich, um die ersten Schritte der Evolution bestehender Varianten zu verstehen, können jedoch nicht erklären, wie mehrere Mutationen über längere Evolutionsverläufe hinweg interagieren. Daher bleibt unklar, wie Kombinationen von Mutationen, wie sie bei Omicron beobachtet wurden, interagieren, um sowohl der Immunität zu entgehen als auch eine starke Affinität zu ACE2 beizubehalten. Um diese Frage zu beantworten, haben wir einen kombinatorischen Assemblierungsansatz verwendet, um eine Plasmidbibliothek zu erstellen, die alle möglichen Kombinationen der 15 Mutationen im Omicron BA.1 RBD enthält (insgesamt 215 = 32.768 Varianten). Diese Bibliothek, die bislang die größte kombinatorisch vollständige Bibliothek eines viralen Proteins darstellt, umfasst alle möglichen evolutionären Zwischenprodukte zwischen dem Wuhan Hu-1 und dem Omicron BA.1 RBD. Wir haben diese Plasmidbibliothek in einen Standard-Hefe-Display-Stamm transformiert und so eine Hefebibliothek erstellt, in der jede Zelle eine einzelne monomere RBD-Variante aufweist, die dem Plasmid in dieser Zelle entspricht. Anschließend verwendeten wir Tite-Seq, eine Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie- und Sequenzierungsmethode (siehe „Methoden“; ergänzende Abbildung 1A), um die Bindungsaffinitäten KD,app aller 32.768 RBD-Varianten für menschliches ACE2 zu messen parallel zu.

In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten von uns selbst14 und anderen9,13,15 stellen wir fest, dass die Tite-Seq-Messungen hoch reproduzierbar sind (SEM von 0,2 log KD,app zwischen dreifachen Messungen) und mit unabhängigen Messungen mit niedrigem Durchsatz konsistent sind (siehe „Methoden“; Ergänzende Abb. 1b–f). Wir stellen fest, dass unsere Bindungsaffinitätsmessungen aufgrund unterschiedlicher Gating-Strategien geringfügige systemische Unterschiede zu einer früheren Studie9 aufweisen, die relativen Affinitäten jedoch zwischen den beiden Datensätzen konsistent sind (ergänzende Abbildung 1f). Darüber hinaus stellen wir minimale Unterschiede in den RBD-Expressionsniveaus fest und können daher KD,app für die gesamte kombinatorische Bibliothek ableiten (siehe „Methoden“; ergänzende Abbildung 3).

Wir stellen fest, dass alle 32.768 RBD-Zwischenprodukte zwischen Wuhan Hu-1 und Omicron BA.1 eine nachweisbare Affinität zu ACE2 aufweisen, wobei KD,app zwischen 0,1 μM und 0,1 nM liegt (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1; siehe https://desai -lab.github.io/wuhan_to_omicron/ für einen interaktiven Datenbrowser). In Übereinstimmung mit früheren Studien10 weist der BA.1-RBD im Vergleich zu Wuhan Hu-1 eine leichte (sowohl durch Tite-seq- als auch durch isogene Messungen verdreifachte) Verbesserung der Bindungsaffinität auf (ergänzende Abbildung 2). Allerdings zeigen die meisten (~60 %) der intermediären RBD-Sequenzen tatsächlich eine schwächere Bindungsaffinität zu ACE2 als die ursprüngliche Wuhan Hu-1 RBD. Tatsächlich gibt es keine Pfade von Wuhan Hu-1 zu Omicron BA.1, die nicht mindestens einen Schritt enthalten, der die ACE2-Affinität verringert. Dies liegt hauptsächlich daran, dass die überwiegende Mehrheit der BA.1-Mutationen bei den meisten genetischen Hintergründen einen neutralen oder schädlichen Effekt auf die ACE2-Affinität hat (Abb. 1b). Dies gilt insbesondere für K417N, G446S, Q493R, G496S und Y505H, von denen vier bekanntermaßen an der Flucht vor verschiedenen Klassen monoklonaler Antikörper beteiligt sind16,17,18.

a Verteilung der Bindungsaffinitäten zu ACE2 über alle getesteten N=32.768 RBD-Genotypen. Bindungsaffinitäten werden als -logKD,app angezeigt; Vertikale blaue und rote Linien zeigen die -logKD,App für Wuhan Hu-1 bzw. Omicron BA.1 an. b Verteilungen der Wirkung jeder Mutation auf die ACE2-Affinität (definiert als die Änderung von -logKD,app aufgrund der Mutation) über alle möglichen genetischen Hintergründe an den anderen 14 Loci. Schwarze Liniensegmente geben das 25. und 75. Perzentil der Effektverteilungen an und Punkte stellen Verteilungsmittelwerte dar, n=16384 Hintergründe. Blaue und rote Punkte geben Auswirkungen auf Wuhan Hu-1 bzw. die am häufigsten mutierten Hintergründe an. c Verteilung der Bindungsaffinitäten, gruppiert nach Anzahl der Omicron BA.1-Mutationen. Die Bindungsaffinität der Wuhan Hu-1-Variante wird durch die horizontale gestrichelte Linie angezeigt. Die Kästchen entsprechen dem Bereich zwischen dem 25. und 75. Perzentil, und die Whiskers erstrecken sich bis zum größten/kleinsten Wert, der nicht weiter als das 1,5-fache des Interquartilbereichs beträgt.

Obwohl viele BA.1-Mutationen die ACE2-Affinität im Durchschnitt verringern, führen die Wechselwirkungen zwischen diesen Mutationen zu einer Verbesserung der ACE2-Affinität für BA.1 im Vergleich zum angestammten Wuhan-Hu-1-Stamm. Das heißt, Mutationen wirken sich tendenziell schädlicher auf die ACE2-Affinität aus, wenn nur wenige andere Mutationen vorhanden sind. Bei Vorhandensein mehrerer anderer Mutationen neigen sie jedoch dazu, neutral oder sogar vorteilhaft zu werden (Abb. 1c; ergänzende Abb. 4). In Übereinstimmung damit stellen wir fest, dass, obwohl die meisten der 15 RBD-Mutationen die ACE2-Affinität im Wuhan Hu-1-Hintergrund (und in vielen Fällen auch in den meisten anderen Hintergründen) verringern, sie alle bei den am stärksten mutierten Mutationen weniger schädlich oder sogar vorteilhaft sind Hintergrund (Abb. 1b). Dieses Muster erklärt, warum die BA.1-RBD eine stärkere Affinität zu ACE2 aufweist, obwohl sie so viele Mutationen enthält, die einzeln die ACE2-Affinität verringern: Ihre schädlichen Auswirkungen werden durch kompensatorische epistatische Wechselwirkungen mit anderen Mutationen abgeschwächt.

Um Mutationseffekte und Wechselwirkungen systematisch zu analysieren, passen wir ein biochemisches Standardmodell der Epistase19 an unsere Daten an. Dies zerlegt unser gemessenes -log(KD,app) (von dem erwartet wird, dass es proportional zur freien Bindungsenergie ΔG ist)20,21 in eine Summe von Effekten aus einzelnen Mutationen, paarweiser Epistase und epistatischen Wechselwirkungen höherer Ordnung zwischen größeren Sätze von Mutationen (abgeschnitten in fünfter Ordnung; ergänzende Abbildung 5, siehe „Methoden“). Konkret schreiben wir die Bindungsaffinität einer Sequenz s als

wobei \({C}_{i}\) alle \(\left(\begin{array}{c}L\\ i\end{array}\right)\) Kombinationen von \(i\) Mutationen und enthält \({x}_{c,s}\)ist gleich 1, wenn die Sequenz \(s\)alle Mutationen in \(c\) enthält, andernfalls 0 (siehe Methoden; alle Koeffizienten für \(c\) ) mit \(i\) Mutationen werden als Koeffizienten i-ter Ordnung bezeichnet). Dieses Modell liefert Koeffizienten, die mit alternativen Modellen der statistischen (ergänzende Abbildung 6) und globalen22 (ergänzenden Abbildung 7) Epistase vergleichbar sind. Im Allgemeinen stellen wir fest, dass die Größenordnung der Effekte erster Ordnung einzelner Mutationen (Abb. 2a) mit der ACE2-Kontaktoberfläche des entsprechenden Rests korreliert (Abb. 2b, c) und dass benachbarte Reste mit größerer Wahrscheinlichkeit paarweise stark sind Wechselwirkungen (Abb. 2e), wie wir es aus früheren Arbeiten erwarten können14,23.

a Effekte erster Ordnung im am besten passenden epistatischen Interaktionsmodell (bis zur fünften Ordnung). Fehlerbalken stellen Standardfehler aus der Modellanpassung dar und sind auf den Mittelwert n=16.384 zentriert. b Co-Kristallstruktur des Omicron BA.1 RBD- und ACE2-Rezeptors (PDB ID 7WPB). Mutierte Reste werden als Kugeln dargestellt, die wie in (a) gefärbt sind. c Effekte erster Ordnung für jede Mutation, aufgetragen gegen die Kontaktoberfläche zwischen dem entsprechenden BA.1-RBD-Rest und ACE2. Mutationen gefärbt wie in (a). Der Rangkorrelationskoeffizient (rs) nach Spearman zwischen Effekt erster Ordnung und Kontaktfläche ist oben links angegeben. d Epistatische Interaktionskoeffizienten zweiter Ordnung und Interaktionskoeffizienten höherer Ordnung. Für jede Mutation wird der Interaktionskoeffizient höherer Ordnung (unten im Heatmap-Diagramm angezeigt) berechnet, indem alle Interaktionskoeffizienten dritter und vierter Ordnung summiert werden, an denen die Mutation beteiligt ist. e Paarweise Wechselwirkungskoeffizienten aufgetragen gegen die Abstände zwischen den jeweiligen Alpha-Kohlenstoffen. Mutationen werden durch paarweise Koeffizienten wie in (d) gefärbt. Der Rangkorrelationskoeffizient (rs) nach Spearman ist oben links angegeben.

Unsere abgeleiteten paarweisen Koeffizienten und Koeffizienten höherer Ordnung zeigen, dass starke kompensatorische Wechselwirkungen die Auswirkungen affinitätsreduzierender Mutationen ausgleichen (Abb. 2d). Das Ausmaß dieser Wechselwirkungen ist vergleichbar mit dem der Effekte erster Ordnung, und diese Epistase ist überwiegend positiv, da der Ausschluss epistatischer Begriffe zu einer konsequenten Unterschätzung der vorhergesagten Affinität führt (ergänzende Abbildung 8). Diese starke positive Epistase bedeutet, dass Mutationen, die die ACE2-Affinität verringern, in Hintergründen, die andere Mutationen enthalten, weniger schädlich werden. Beispielsweise wird der negative Effekt erster Ordnung von Q498R durch seine Interaktion mit der nahegelegenen Mutation N501Y vollständig umgekehrt; Diese paarweise Interaktion wurde in früheren Arbeiten8,11,24 als Beispiel einer kompensatorischen Epistase hervorgehoben. Darüber hinaus identifizieren wir zahlreiche andere interagierende Mutationen, darunter noch stärkere positive Interaktionen (zusammen mit Effekten dritter und vierter Ordnung) zwischen Q498R, G496S, N501Y und Y505H (Abb. 2d). Tatsächlich wird die ACE2-Affinität durch viele weitere signifikante Wechselwirkungen höherer Ordnung beeinflusst, von denen die meisten diese vier Mutationen umfassen (bis zur fünften Ordnung; Ergänzende Daten 1).

Unsere Epistase-Analysen zeigen, dass eine solche kompensatorische Epistase höherer Ordnung die stark schädlichen Auswirkungen von Mutationen, die an der Antikörperflucht beteiligt sind, auf die ACE2-Affinität eliminiert. Dieser Ausgleich zwischen spezifischen vorteilhaften Mutationen (insbesondere N501Y) und Immun-Escape-Mutationen wurde in früheren Studien beobachtet8,25,26,27. Hier quantifizieren wir das Ausmaß dieser Epistase und damit ihren Einfluss auf die Gestaltung der gesamten RBD-Sequenzaffinitätslandschaft. Konkret haben frühere Arbeiten gezeigt, dass fünf BA.1-Mutationen (K417N, G446S, E484A, Q493R und G496S) einen besonders starken Effekt bei der Förderung der Antikörperflucht haben4,17,18. Diese Mutationen verringern alle einzeln die Affinität zu ACE2 sowohl im Durchschnitt als auch im Wuhan Hu-1-Hintergrund (außer E484A; Abb. 1b, 2a, 3a), und die Kombination aller fünf ist stark schädlich (Abb. 3a, b). Eine starke Epistase höherer Ordnung mit dem Paar Q498R und N501Y mildert dies jedoch: Entweder N501Y oder Q498R allein reduzieren die Kosten der fünf Escape-Mutationen, und die Kombination beider kompensiert diese schädlichen Effekte fast vollständig (Abb. 3b). Während diese Escape-Mutationen auch von Wechselwirkungen mit anderen Mutationen profitieren (ergänzende Abbildung 9), sind N501Y und Q498R für den Großteil des kompensatorischen Effekts verantwortlich. Wir stellen fest, dass starke kompensatorische Wechselwirkungen auch die schädliche Wirkung von Y505H abschwächen (Abb. 3c). Es wurde bisher nicht gezeigt, dass diese Mutation stark an der Antikörperflucht beteiligt ist, aber das von uns beobachtete Kompensationsmuster legt nahe, dass sie in irgendeiner Weise funktionell relevant sein könnte.

a ACE2-Bindungsaffinitäten für Varianten, die Mutationen enthalten, die einen starken Einfluss auf das Antikörper-Escape haben: K417N, G446S, E484A, Q493R und G496S, gruppiert nach dem Vorhandensein kompensatorischer Mutationen (Q498R und N501Y). Die gestrichelte blaue (bzw. rote) Linie zeigt die ACE2-Bindungsaffinität von Wuhan Hu-1 (bzw. Omicron BA.1) an. Kästchen stellen den Interquartilbereich dar. b Die Änderungen der ACE2-Bindungsaffinitäten für Varianten, die eine (oder alle) ausgewählter Escape-Mutationen enthalten, gruppiert nach dem Vorhandensein kompensatorischer Mutationen (Q498R und N501Y). Die gestrichelte Linie zeigt an, dass sich die Affinität nicht geändert hat. Kästchen stellen den Interquartilbereich dar. c ACE2-Bindungsaffinitäten für Varianten, die Y505H und Antikörper-Escape-Mutationen enthalten, dargestellt wie in (a).

Die ausgedehnte Epistase, die wir beobachten, bedeutet, dass die individuellen Auswirkungen jeder dieser 15 Mutationen sowie die paarweisen Wechselwirkungen zwischen ihnen in anderen Viruslinien wahrscheinlich unterschiedlich sind. Frühere Arbeiten haben jedoch gezeigt, dass die oben beschriebenen Antikörper-Escape-Mutationen (K417N, G446S, E484A, Q493R und G496S) die ACE2-Affinität in mehreren anderen Varianten (einschließlich Alpha, Beta, Eta und Delta) in ähnlicher Weise verringern8. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis stellen wir fest, dass diese Mutationen zusammen mit anderen, die unserer Meinung nach einen negativen Effekt erster Ordnung auf die ACE2-Affinität haben, in der gesamten SARS-CoV-2-Phylogenie selten auftreten (Abb. 4a). Dies deutet darauf hin, dass die Aufrechterhaltung der Affinität zu menschlichem ACE2 wahrscheinlich ein wichtiger Aspekt der viralen Fitness ist, weshalb diese Mutationen typischerweise dagegen selektiert werden. In ähnlicher Weise stellen wir fest, dass Mutationen mit negativen Auswirkungen auf die ACE2-Affinität, die durch epistatische Wechselwirkungen mit N501Y kompensiert werden, dazu neigen, in der gesamten SARS-CoV-2-Phylogenie in Stämmen, die auch N501Y haben, angereichert zu sein, im Vergleich zu Stämmen, die dies nicht tun (Abb. 4b; andere paarweise Interaktionen treten zu selten auf, um sie testen zu können). Dies deutet weiter darauf hin, dass zumindest einige der von uns beobachteten paarweisen epistatischen Wechselwirkungen auch in anderen Hintergründen vorhanden sind und dass die virale Evolution die Kompensation der Verringerung der ACE2-Affinität begünstigt hat.

a Häufigkeit des Auftretens jeder Mutation in den auf GISAID verfügbaren SARS-CoV-2-Sequenzen (siehe „Methoden“) als Funktion ihrer durchschnittlichen Auswirkung auf die ACE2-Affinität in unseren Daten. Fehlerbalken geben die Standardabweichung der Effektgrößen an und sind auf den Mittelwert zentriert (n=16384 Hintergründe). Der Rangkorrelationskoeffizient (rs) nach Spearman ist oben links angegeben. (b) Normalisierte Häufigkeit von Mutationen, die gleichzeitig mit N501Y in den auf GISAID verfügbaren SARS-CoV-2-Sequenzen auftreten (berechnet auf der Grundlage der Häufigkeit, mit der jede Mutation im selben Zweig wie N501Y auftritt, normalisiert durch ihre Gesamthäufigkeit; siehe „Methoden“) ) als Funktion des Unterschieds in ihrer Wirkung auf die ACE2-Affinität in Gegenwart von N501Y. Fehlerbalken geben die Standardabweichung der Effekte an und sind auf den Mittelwert zentriert (n=8096 Hintergründe). Der Rangkorrelationskoeffizient (rs) nach Spearman ist oben links angegeben. c ACE2-Affinitätsverläufe für 100 zufällig ausgewählte Signalwege (einschließlich aller 15 Mutationen), dargestellt als Funktion der Anzahl der Mutationen mit starker Auswirkung auf das Antikörper-Escape (K417N, G446S, E484A, Q493R und G496S) und dem Vorhandensein oder Fehlen kompensatorischer Mutationen Q498R und N501Y (mit Farben dargestellt). Jede Trajektorie stellt eine mögliche Mutationsreihenfolge dar, beginnend beim Wuhan Hu-1-Genotyp und endend bei Omicron BA.1.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Entwicklung des Antikörper-Escape in BA.1 aufgrund der kompensatorischen Wechselwirkungen mit zahlreichen anderen Mutationen, die nur in dieser Linie vorkommen, ohne Unterbrechung der Bindung an ACE2 möglich war. Während Signaturen dieser Selektionsdrücke und epistatischen Interaktionen in der gesamten viralen Phylogenie28 vorhanden sind und Antikörper-Escape-Varianten durch andere Kombinationen von Mutationen hätten kompensiert werden können, ist es nur die BA.1-Linie, die diese spezielle Kombination interagierender kompensatorischer Mutationen akkumuliert hat.

Unsere Ergebnisse geben auch Aufschluss darüber, warum der bei Omicron BA.1 beobachtete Immun-Escape-Phänotyp nicht als Folge von Mutationen entstanden ist, die sich innerhalb der damals weit verbreiteten Delta-Variante anhäuften. Insbesondere ist es unwahrscheinlich, dass sich die Kombination mehrerer Mutationen, die sowohl für die Immunflucht als auch für die Aufrechterhaltung der Affinität zu ACE2 erforderlich sind (Abb. 4c), im Zusammenhang mit akuten Infektionen angesammelt hat, bei denen es nur wenige Mutationen zwischen Übertragungsengpässen und einem vermutlich starken Selektionsdruck auf beide Funktionen gibt29. Im Gegensatz dazu können bei chronischen Infektionen (z. B. bei einem immungeschwächten Wirt) große Populationsgrößen und ein geringerer Selektionsdruck die Anhäufung der vielen Mutationen ermöglichen, die sowohl zur Aufrechterhaltung der ACE2-Affinität als auch zur Umgehung neutralisierender Antikörper erforderlich sind30,31. Alternativ könnte sich BA.1, wie zuvor vermutet32,33, in einem Tierreservoir entwickelt haben, in dem der Selektionsdruck möglicherweise ebenfalls gelockert wurde. In beiden Fällen könnten die kompensatorischen Mutationen den Immun-Escape-Mutationen vorausgegangen sein, wodurch ihre ansonsten schädlichen Auswirkungen auf die ACE2-Affinität minimiert werden. Alternativ könnte eine entspannte Selektion für die Bindung von ACE2 eine permissive Umgebung für die Immun-Escape-Mutationen geschaffen haben, gefolgt von einer Kompensation, die dann die Ausbreitung der Variante auf andere Wirte ermöglichte. Die phylogenetische Analyse stützt die erste Möglichkeit, da zwei Immun-Escape-Mutationen (G446S und G496S) spät in der BA.1-Evolution auftreten (und nicht mit der BA.2-Linie geteilt werden; ergänzende Abbildung 10). Darüber hinaus bevorzugt ein starkes Selektionsmodell, das auf der ACE2-Affinität basiert, dass die drei BA.1-spezifischen Mutationen spät in der Evolution auftreten, wie in der Phylogenie beobachtet (ergänzende Abbildung 11). Unabhängig von der genauen Reihenfolge der Mutationen könnten die große Viruspopulation und der gelockerte Selektionsdruck einer chronischen Infektion Bedingungen geschaffen haben, die die Fixierung der verschiedenen Mutationen begünstigen, die BA.1 benötigt, um neutralisierenden Antikörpern zu entgehen und gleichzeitig die ACE2-Affinität aufrechtzuerhalten.

Wir betonen, dass sich unsere Arbeit auf 15 Mutationen innerhalb einer bestimmten Region eines Proteins beschränkt und daher mögliche Wechselwirkungen mit den vielen anderen Mutationen außerhalb der RBD, die in der Omicron BA.1-Linie vorhanden sind, vernachlässigt. Wir stellen jedoch fest, dass Wechselwirkungen zwischen RBD-Mutationen allein ausreichen, um zu erklären, wie die ACE2-Affinität aufrechterhalten wird, was nicht nur aus den Daten einzelner Mutanten ersichtlich ist. Darüber hinaus stellen wir auch fest, dass sich die positiven Wechselwirkungen auf die ACE2-Affinität negativ auf andere Phänotypen auswirken könnten. Beispielsweise könnten diese Wechselwirkungen die Immunumgehung hemmen, und daher ist es notwendig, auch die daraus resultierenden Auswirkungen dieser Wechselwirkungen auf die Immunumgehung abzubilden. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass die Spike-Protein-Expression und -Stabilität auch eine Schlüsselrolle bei der viralen Evolution spielen. Einige Hinweise auf diesen Trend finden wir in unseren Daten. Beispielsweise identifizieren wir eine signifikante synergistische Wechselwirkung zwischen S371L, S373P und S375F, die die RBD-Expression in Hefe verbessert. Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten, die zeigen, dass dieser Mutationssatz mit der Stabilisierung einer dichter gepackten Konformation des RBD34 verbunden ist (Ergänzung). Abb. 4). Darüber hinaus dürften auch zahlreiche andere Phänotypen relevant sein.

Trotz dieser Vorbehalte zeigen unsere Ergebnisse, dass Schlüsselereignisse in der viralen Evolution von Epistasemustern höherer Ordnung abhängen können. Wir stellen fest, dass diese epistatischen Wechselwirkungen fast ausschließlich synergistisch oder kompensatorisch sind, ein Muster, das ein allgemeines neu auftretendes Merkmal von Viren sein könnte, die sich in einer immunbeschränkten Landschaft entwickeln. Dies kann besonders wichtig für komplexe adaptive Ereignisse sein, die zahlreiche Mutationen beinhalten, wie z. B. Immunflucht und Wirtswechsel. Um die Zukunft der viralen Evolution vorherzusagen, müssen wir daher über Hochdurchsatz-Screenings einzelner Mutationen hinausgehen und den kombinatorischen Sequenzraum umfassender analysieren. Eine zentrale Herausforderung ist die Größe dieses Sequenzraums, die eine umfassende Erkundung schwierig macht. Die Generierung spezifischer kombinatorischer Landschaften wie der hier vorgestellten kann jedoch dazu beitragen, allgemeine Muster der Epistase aufzudecken, die die Virusentwicklung in komplexen Umgebungen beeinflussen.

Um klonale Hefestämme für die Varianten Wuhan Hu-1 und Omicron BA.1 zu erzeugen, haben wir den entsprechenden RBD-gblock (IDT, Supplementary Data 2) in den pETcon-Hefeoberflächen-Display-Vektor (Plasmid 2649; Addgene, Watertown, MA, #166782) kloniert ) über Gibson Assembly. Die Sequenz des gblocks wurde für Hefe codonoptimiert (unter Verwendung des Twist Bioscience-Algorithmus); Wir fanden heraus, dass die Codon-Optimierung einen erheblichen Einfluss auf die Anzeigeeffizienz hatte. Darüber hinaus haben wir für die Bibliothekskonstruktion (unten beschrieben) zwei vorhandene Bsa-I-Stellen aus dem Plasmid durch ortsspezifische Mutagenese gelöscht (Agilent, Santa Clara, CA, Nr. 200521). Bei der klonalen Stammproduktion wurden Gibson Assembly-Produkte gemäß dem Herstellerprotokoll in elektrokompetente NEB 10-Beta-E. coli-Zellen (NEB, Ipswich, MA, #C3020K) transformiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden die Zellen geerntet und die resultierenden Plasmide gereinigt und Sanger-sequenziert. Wir transformierten Plasmide mit den richtigen Sequenzen in den Hefestamm AWY101 (freundliche Spende von Dr. Eric Shusta)35, wie von Gietz und Schiestl36 beschrieben. Die Transformanten wurden auf SDCAA-Agar (1,71 g/L YNB ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat [Sigma-Aldrich #Y1251], 5 g/L Ammoniumsulfat [Sigma-Aldrich #A4418], 2 % Dextrose [VWR #90000–904] ausplattiert ], 5 g/L Bacto-Casaminosäuren [VWR #223050], 100 g/L Ampicillin [VWR #V0339], 2 % Difco Noble Agar [VWR #90000–774]) und 48 Stunden bei 30 °C inkubiert. Mehrere Kolonien wurden erneut auf SDCAA-Agar ausgestrichen und erneut 48 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Klonale Hefestämme wurden gepflückt, inokuliert und bis zur Sättigung in flüssigem SDCAA (6,7 g/L YNB ohne Aminosäure VWR #90004-150), 5 g/L Ammoniumsulfat (Sigma-Aldrich #A4418), 2 % Dextrose (VWR # 90000–904), 5 g/L Bacto-Casaminosäuren (VWR #223050), 1,065 g/L MES-Puffer (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, #70310), 100 g/L Ampicillin (VWR # V0339)) bei 30 °C und gemischt mit 5 % Glycerin zur Lagerung bei −80 °C.

Wir haben die RBD-Variantenbibliothek mit einer kombinatorischen Golden-Gate-Montagestrategie generiert. Zuerst haben wir die RBD-Sequenz in fünf Fragmente mit etwa gleicher Länge unterteilt, die zwischen 90 und 131 bp liegen und jeweils zwischen 1 und 4 Mutationen enthalten. Wir haben BsaI-Stellen und Überhänge an beiden Enden jeder Fragmentsequenz eingeführt. Diese Überhänge enthielten BsaI-Schnittstellen, die es den fünf Fragmenten ermöglichen würden, sich innerhalb des Plasmidrückgrats eindeutig in ihrer richtigen Reihenfolge zusammenzusetzen. Für jedes Fragment mit n Mutationen haben wir 2n Fragmentversionen generiert, indem wir die Fragmente entweder per PCR produzierten (Fragmente 1–4) oder einzelne DNA-Duplexe (Fragment 5) von IDT kauften. Diese Permutationen stellten sicher, dass alle möglichen Mutationskombinationen in die Bibliothek aufgenommen wurden. In Fragment 2 haben wir auch eine synonyme Substitution am K378-Rest eingefügt, die der K417N-Mutation entspricht. Diese Substitution ermöglicht die Sequenzierung der Amplikonbibliothek auf dem Illumina Novaseq SP (2x250bp). Für die dsDNA-Produktion mittels PCR haben wir die Fragmente so gestaltet, dass die darin enthaltenen Mutationen nahe am 3′- oder 5′-Ende liegen. Dieses Design ermöglichte es den Primern, die während der PCR ausgewählten Mutationen, BsaI-Stellen und einzigartigen Überhänge gleichzeitig einzuschließen und einzuführen. Wir haben jede Version jedes Fragments einzeln hergestellt (insgesamt 28 PCR-Reaktionen; Ergänzende Daten 3) und die Produkte jedes Fragments in äquimolaren Verhältnissen gepoolt. Darüber hinaus haben wir alle 16 gekauften DNA-Duplexe, die das fünfte Fragment kodieren, in äquimolaren Verhältnissen gepoolt. Anschließend erstellten wir einen endgültigen Fragmentmix, indem wir die fünf Fragmentpools zusammenfassten. Bei der Golden-Gate-Reaktion würden die Versionen jedes Fragments in zufälligen Kombinationen miteinander ligiert, wodurch alle Sequenzen mit ungefähr gleichen Häufigkeiten erzeugt würden.

Zusätzlich zum Fragmentmix haben wir vier Versionen des Plasmidrückgrats für die Golden Gate-Reaktion vorbereitet. Jede Version enthält eine Kombination der Mutationen N501Y und Y505H. Vor dem Zusammenbau führten wir anstelle der Fragment-Insert-Region den Gegenselektionsmarker ccdB mit flankierenden BsaI-Stellen ein (Supplementary Data 3). Wir führten die Golden-Gate-Klonierung unter Verwendung des Golden Gate Assembly Mix (NEB, Ipswich, MA, #E1601L) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll mit einem molaren Verhältnis von Fragment-Insert-Pool zu Plasmid-Rückgrat von 7:1 durch. Wir haben die Assemblierungsprodukte in 6 × 25 μl Zellaliquots in elektrokompetente NEB 10-Beta-E. coli-Zellen umgewandelt. Anschließend übertrugen wir jede der gewonnenen Zellkulturen in 100 ml geschmolzenes LB (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl), das 0,3 % SeaPrep-Agarose (VWR, Radnor, PA #12001–922) enthielt, und verteilten es in einer dünnen Schicht in einem 1-L-Kolben mit Schikanen (ca. 1 cm tief). Die Mischung wurde drei Stunden lang bei 4 °C gehalten und anschließend 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Wir haben insgesamt 3 Millionen Transformanten in allen Aliquots beobachtet. Um die Plasmidbibliothek zu isolieren, haben wir die Flaschen durch einstündiges Schütteln gemischt und die Zellen für Standard-Plasmid-Maxiprep (Zymo Research, Irvine, CA, D4201) pelletiert, woraus wir > 90 μg gereinigtes Plasmid erhalten haben.

Anschließend transformierten wir die gereinigte Plasmidbibliothek wie oben beschrieben in AWY101-Zellen. Wir haben Transformanten in einem geschmolzenen SDCAA-Agarosegel (1,71 g/L YNB ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (Sigma-Aldrich #Y1251), 5 g/L Ammoniumsulfat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, #A4418) gewonnen. 2 % Dextrose (VWR Nr. 90000–904), 5 g/L Bacto-Casaminosäuren (VWR Nr. 223050), 100 g/L Ampicillin (VWR Nr. V0339) mit 0,35 % SeaPrep-Agarose (VWR Nr. 12001–922), verteilt in einem dünne Schicht (ca. 1 cm tief). Die Mischung wurde drei Stunden lang bei 4 °C gehalten und anschließend 48 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Aus fünf Aliquots erhielten wir etwa 1,2 Millionen Kolonien. Nachdem wir die Flaschen eine Stunde lang durch Schütteln gemischt hatten, züchteten wir Zellen fünf Generationen lang in 5-ml-Röhrchen mit flüssigem SDCAA und lagerten die gesättigte Kultur in 1-ml-Aliquoten, ergänzt mit 5 % Glycerin, bei –80 °C.

Tite-Seq wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt36. Wir führten drei Wiederholungen des Tests an verschiedenen Tagen durch. In den ersten beiden Replikaten enthielt ein kleiner Teil der Bibliotheksvarianten eine Off-Target-Mutation (E484W) anstelle der beabsichtigten Mutation (E484A). Diese Varianten wurden aus der Datenanalyse entfernt und im dritten Replikat wurde die Bibliothek um Varianten ergänzt, die die beabsichtigte Mutation (E484A) enthielten.

Zuerst haben wir Hefe-RBD-Bibliotheken sowie die klonalen Stämme Wuhan Hu-1 und Omicron BA.1 aufgetaut, indem wir 150 μl der entsprechenden Glycerin-Stammlösung (gesättigte Kultur mit 5 % Glycerin, gelagert bei –80 °C) in 5 ml SDCAA beimpften 30 °C für 20 Stunden. Am nächsten Tag wurden die Hefekulturen in 5 ml SGDCAA (6,7 g/L YNB ohne Aminosäure VWR #90004-150), 5 g/L Ammoniumsulfat (Sigma-Aldrich #A4418) und 2 % Galactose auf OD600 = 0,67 verdünnt (Sigma-Aldrich #G0625), 0,1 % Dextrose (VWR #90000–904), 5 g/L Bacto-Casaminosäuren (VWR #223050), 1,065 g/L MES-Puffer (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, #70310) , 100 g/L Ampicillin (VWR # V0339)) und 16–20 Stunden bei Raumtemperatur rotieren lassen.

Nach der Induktion über Nacht wurden die Hefekulturen pelletiert, zweimal mit 0,01 % PBSA (VWR Nr. 45001–130; GoldBio, St. Louis, MO, Nr. A-420–50) gewaschen und auf eine OD600 von 1 resuspendiert. Insgesamt 500 -700 μl OD1-Hefezellen wurden mit biotinyliertem humanem ACE2 (Acrobiosystems #AC2-H2H82E6) in jeder der zwölf ACE2-Konzentrationen (Halblogarithmus-Schritte von 10–12,5–10–7 M) markiert, wobei die Volumina angepasst wurden, um die Ligandenverarmung zu begrenzen Die Auswirkungen dürften weniger als 10 % betragen (unter der Annahme von 50.000 Oberflächen-RBD/Zelle37). Hefe-ACE2-Mischungen wurden 20 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und rotiert. Nach der Inkubation wurden die Hefe-ACE2-Komplexe durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 3000 × g und 4 °C pelletiert, zweimal mit 0,5 % PBSA + 2 mM EDTA gewaschen und anschließend mit Streptavidin-RPE (1:100, Thermo Fisher #) markiert. S866) und Anti-cMyc-FITC (1:50, Miltenyi Biotec, Somerville, MA, Nr. 130-116-485) bei 4 °C für 45 Minuten. Nach dieser sekundären Markierung wurde die Hefe zweimal mit 0,5 % PBSA + 2 mM EDTA gewaschen und bis zur Sortierung im Dunkeln auf Eis gelassen.

Wir sortierten den Hefebibliothekskomplex auf einem BD FACS Aria Illu, ausgestattet mit 405-nm-, 440-nm-, 488-nm-, 561-nm- und 635-nm-Lasern und einer festen 85-Mikron-Düse. Um die spektralen Überlappungseffekte zu minimieren, haben wir die Kompensation zwischen FITC und PE mithilfe von Einzel-Fluorophor-Kontrollen ermittelt. Einzelne Zellen wurden zunächst durch FSC vs. SSC erfasst und dann entweder nach Expressions- (FITC) oder Bindungsfluoreszenz (PE) sortiert. Für jede Probe wurden mindestens eine Million Zellen sortiert. Bei der Ausdruckssortierung wurden Singuletts (basierend auf FSC vs. SSC) in acht äquivalente FITC-Bins mit logarithmischem Abstand sortiert. Für die Bindungssortierung wurden FITC+-Zellen in 4 PE-Behälter sortiert (die PE-Population umfasste Behälter 1, und die PE+-Population wurde in drei äquivalente logarithmisch beabstandete Behälter 2–414,37 aufgeteilt. Die sortierten Zellen wurden in beschichteten Polypropylenröhrchen gesammelt gefüllt mit 1 ml YPD, ergänzt mit 1 % BSA. Nach der Erholung wurden die Zellen durch 10-minütiges Zentrieren bei 3000 xg pelletiert und in 4 ml SDCAA resuspendiert. Die Kulturen wurden bei 30 °C bis zur späten logarithmischen Phase (OD600 = 0,9–) rotiert. 1.4).

1,5 ml Spät-Log-Hefekulturen wurden pelletiert und vor der Extraktion mindestens sechs Stunden lang bei –20 °C gelagert. Hefe-Display-Plasmide wurden mit Zymo Yeast Plasmid Miniprep II (Zymo Research # D2004) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert und in einem 17 μl Elutionspuffer eluiert. RBD-Amplikon-Sequenzierungsbibliotheken wurden durch eine zweistufige PCR wie zuvor beschrieben14,38 hergestellt. In der ersten PCR wurden eindeutige molekulare Identifikatoren (UMI), Inline-Indizes und partielle Illumina-Adapter über sieben Amplifikationszyklen an die Sequenzbibliothek angehängt, um PCR-Amplifikationsverzerrungen zu minimieren. Wir verwendeten 5 μL Plasmid-DNA als Vorlage in einem 25 μL Reaktionsvolumen mit Q5-Polymerase gemäß dem Protokoll des Herstellers (NEB # M0491L). Die Reaktion wurde in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm inkubiert: 1. 60 s bei 98 °C, 2. 10 s bei 98 °C, 3. 30 s bei 66 °C, 4. 30 s bei 72 °C, 5. GOTO 2, 6x, 6. 60 s bei 72 °C. Kurz nach Abschluss der Reaktion fügten wir 25 μl Wasser zu den Reaktionen hinzu und führten eine 1,2-fache Magnetkügelchenreinigung durch (Aline Biosciences #C-1003–5). Die gereinigten Produkte wurden dann in 35 μL Elutionspuffer eluiert. In der zweiten PCR wurden der Rest des Illumina-Adapters und die probenspezifischen Illumina i5- und i7-Indizes über 35 Amplifikationszyklen angehängt (Ergänzungsdaten 4–5 für Primersequenzen). Wir verwendeten 33 μL des gereinigten PCR1-Produkts als Vorlage in einem Gesamtvolumen von 50 μL unter Verwendung von Kapa-Polymerase (Kapa Biosystems #KK2502) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Diese zweite Reaktion haben wir in einem Thermocycler mit folgendem Programm inkubiert: 1. 30 s bei 98 °C, 2. 20 s bei 98 °C, 3. 30 s bei 62 °C, 4. 30 s bei 72 °C, 5 . GOTO 2, 34x, 6. 300 s bei 72 °C. Die resultierenden Sequenzierungsbibliotheken wurden unter Verwendung von 0,85-fachen Aline-Kügelchen gereinigt, die Amplikongröße wurde durch Laufen auf einem 1 %igen Agarosegel auf etwa 500 bp verifiziert und die Amplikonkonzentration wurde durch fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff (Biotium, Fremont, CA, Nr. 31068) quantifiziert , gemäß Herstelleranweisungen) auf Spectramax i3. Anschließend haben wir die Amplikonbibliotheken entsprechend der Anzahl der sortierten Zellen gepoolt und diesen Pool durch eine zweiseitige Aline-Kügelchenreinigung (0,5–0,9X) weiter größenselektiert. Die endgültige Poolgröße wurde mit den Tapestation 5000 HS und 1000 HS überprüft. Die endgültige Sequenzierungsbibliothek wurde mit einem Qubit-Fluorometer quantifiziert und auf einem Illumina NovaSeq SP mit 10 % PhiX sequenziert.

Wir haben unsere rohen demultiplexten Sequenzierungslesevorgänge verarbeitet, um die Indizes und Mutationsstellen zu identifizieren und zu extrahieren. Zu diesem Zweck haben wir eine Snakemake-Pipeline39 entwickelt, die zunächst alle Fastq-Dateien analysierte und die Lesevorgänge mithilfe der Python-Bibliothek regex40 nach Inline-Indizes, UMIs und Sequenzlesevorgängen trennte. Wir akzeptierten Sequenzen, die mit dem gesamten Lesevorgang (ohne Einschränkungen der Basen an Mutationsstellen) innerhalb einer Toleranz von 10 % bp-Mismatch übereinstimmen. Als nächstes haben wir falsche Inline-Indizes (entsprechend den entsprechenden i5/i7-Indizes) verworfen und Lesesequenzen in binäre Genotypen analysiert („0“ für Wuhan Hu-1-Allel oder „1“ für Omicron BA.1-Allel an jeder Mutationsposition). Lesevorgänge mit Fehlern an Mutationsstellen (d. h. sie stimmten weder mit dem Wuhan Hu-1-Allel noch mit dem Omicron BA.1-Allel überein) wurden verworfen. Schließlich haben wir die Anzahl der unterschiedlichen UMIs für jeden Genotyp gezählt und die Genotypzahlen aller Proben in einer einzigen Tabelle zusammengefasst. Die mittlere Abdeckung aller Replikate betrug etwa 150x.

Um die Bindungsdissoziationskonstanten KD,app für jeden Genotyp anzupassen, haben wir das gleiche Verfahren wie zuvor beschrieben befolgt39. Kurz gesagt, wir haben Sequenzierungs- und Durchflusszytometriedaten verwendet, um die mittlere logarithmische Fluoreszenz jedes Genotyps (s) bei jeder Konzentration (c) wie folgt zu berechnen:

wobei \({F}_{b,c}\) die mittlere logarithmische Fluoreszenz von Bin \(b\) bei der Konzentration \(c\) ist und \({p}_{b,s\vee c} \) ist der abgeleitete Anteil der Zellen aus Genotyp s, die in Behälter \(b\) mit der Konzentration \(c\) sortiert werden. Das \({p}_{b,s\vee c}\) wird wiederum aus den gelesenen Zählungen als geschätzt

wobei \({R}_{b,s,c}\) die Anzahl der Lesevorgänge vom Genotyp s ist, die im Behälter \(b\) bei der Konzentration \(c\) gefunden werden, während \({C}_{ b,c}\) bezieht sich auf die Anzahl der Zellen, die bei der Konzentration \(c\) in den Behälter \(b\) sortiert werden.

Um die Unsicherheit in der mittleren Bin-Schätzung zu verbreiten, haben wir die Formel verwendet

wobei \(\delta {F}_{b,c}\) die Streuung der logarithmischen Fluoreszenz von Zellen ist, die in Behälter \(b\) bei der Konzentration \(c\) sortiert sind. Wie zuvor untersucht, haben wir herausgefunden, dass die Schätzung von \(\delta {F}_{b,c}\ approx \sigma {F}_{b,c}\) ausreicht, um die Variation zu erfassen, die wir in der logarithmischen Fluoreszenz in jedem einzelnen beobachtet haben Behälter. Im Gegensatz dazu ergibt sich der Fehler in \({p}_{b,s\vee c}\) aus dem Stichprobenfehler, der als Poisson-Prozess angenähert werden kann, wenn die Lesezahlen hoch genug sind.

Somit haben wir:

Schließlich haben wir die Bindungsdissoziationskonstante (KD,s) für jede Variante abgeleitet, indem wir den Logarithmus der Hill-Funktion an die mittlere logarithmische Fluoreszenz\({\bar{F}}_{s,c}\) als Funktion angepasst haben der ACE2-Konzentrationen \(c\):

Dabei ist \({A}_{s}\) der Anstieg der Fluoreszenz bei ACE2-Sättigung und \({B}_{s}\) der Hintergrundfluoreszenzpegel. Die Anpassung wurde mit der Funktion „curve_fit“ im Python-Paket scipy.optimize durchgeführt. Über alle Genotypen hinweg haben wir vernünftige Grenzen für die Werte von \({A}_{s}\) auf 102−106, \({B}_{s}\) auf 1-105 und KD,s festgelegt 10−14−10−5 sein. Anschließend haben wir die abgeleiteten KD,s-Werte über die drei Replikate gemittelt, nachdem wir Werte mit schlechter Anpassung (\({r}^{2}\, < \, 0,8\)) entfernt hatten.

Wir stellen fest, dass sich unser Ansatz hier geringfügig von einigen früheren Arbeiten9,41 unterscheidet, die diese Hill-Funktion häufig direkt unter Verwendung des mittleren Bins mit der folgenden Gleichung anpassen:

anstatt die abgeleiteten mittleren Fluoreszenzwerte zu verwenden. Diese Verwendung durchschnittlicher Klassenwerte führt zu einer Verzerrung, da die Klassennummern proportional zur mittleren logarithmischen Fluoreszenz und nicht zur mittleren Fluoreszenz sind. Daher sind die mit dieser früheren Methode abgeleiteten KD-Werte nicht genau. In unserem Messbereich korrelieren diese Werte jedoch immer noch linear mit unseren Messungen (siehe ergänzende Abbildung 1e).

Wir haben unsere Hochdurchsatz-Bindungsaffinitätsmethode validiert, indem wir 10 spezifische RBD-Klone für die Validierung mit niedrigerem Durchsatz ausgewählt haben: Wuhan Hu-1, Omicron, 5 Einzelmutanten (K417N, S477N, T478K, Q498R, N501), zwei Doppelmutanten (Q498R/ N501Y und E484A/Q498R) und ein Genotyp mit vier Mutationen (K417N/E484A/Q498R/N501Y). Für jede isogene Titrationskurve folgten wir der gleichen Markierungsstrategie und titrierten ACE2 bei Konzentrationen im Bereich von 10−12−10−7 M für isogene Hefestämme, die nur die interessierende Sequenz aufweisen. Die mittlere logarithmische Fluoreszenz wurde mit einem BD LSR Fortessa-Zellanalysator gemessen. Wir haben den Mittelwert und die Varianzen dieser Verteilungen für jede Konzentration direkt berechnet und daraus den Wert von –log10 (KD) mithilfe der Formel (siehe oben) abgeleitet (siehe ergänzende Abbildung 1).

Wir haben zunächst ein einfaches lineares Modell verwendet, bei dem sich die Auswirkungen von Mutationskombinationen zum Phänotyp einer Sequenz addieren. Der Logarithmus der Bindungsaffinität \({{\log }}_{10}\left({K}_{D,s}\right)\) ist proportional zu Änderungen der freien Energie, daher in einem Modell ohne Wechselwirkung sie würde additiv kombinieren41. Das vollständige K-Ordnungsmodell kann wie folgt geschrieben werden:

wobei \({\beta }_{c}\) den Koeffizienten für die Kombination der Mutation \(c\) bezeichnet (entweder Einzelmutationskoeffizient für \(i=1\) oder andernfalls Interaktionskoeffizient), enthält alle Kombinationen von i Mutationen und ist gleich 1, wenn die Sequenz alle Mutationen in und bis 0 enthält, andernfalls. Diese Wahl wird „biochemische“ oder „lokale“ Epistasis42 genannt und wird im Haupttext verwendet. Eine andere Option, die als „statistische“ oder „Ensemble“-Epistase bezeichnet wird, besteht darin, die Koeffizienten durch zu ersetzen. In diesem „statistischen“ Modell ist die Basislinie die mittlere Affinität der Population und die Effekte erster Ordnung der Mutationen entsprechen ihrem mittleren Effekt auf die Affinität. Das Ergebnis dieser Analyse und die Unterschiede zum biochemischen Modell präsentieren wir in der ergänzenden Abbildung 6.

Um den optimalen Wert von K auszuwählen, folgen wir der in Phillips und Lawrence et al., 202142, beschriebenen Methode. Kurz gesagt verwenden wir eine 10-fache Kreuzvalidierung, um alle Werte von K ≤ 6 zu testen. Für jeden Wert von K die Daten wird in zehn Teildatensätze aufgeteilt und jeder der zehn Teildatensätze wird als Testsatz für ein Modell verwendet, das auf den restlichen Daten trainiert wird. Wir haben den Wert von K gewählt, der die über alle zehn Testdatensätze gemittelte Vorhersageleistung (R²) maximiert. Für diesen Datensatz haben wir einen optimalen Wert von K = 5 gefunden (Ergänzende Abbildung 5). Schließlich haben wir ein K=5-Modell über den gesamten Datensatz trainiert, um die endgültigen Koeffizienten zu erhalten. Die Anzahl der Parameter des endgültigen Modells (~5000) ist viel geringer als die Anzahl der beobachteten Datenpunkte (215 = 32768).

Wie oben erwähnt, ist der Logarithmus der Bindungsaffinität proportional zu einer Änderung der freien Energie, einer umfangreichen Größe. Dies rechtfertigt theoretisch die Verwendung eines linearen Modells. Dennoch lassen sich die Wechselwirkungen zwischen Mutationen in einigen Szenarien besser durch eine nichtlineare Funktion mit wenigen Parametern erklären, die auf den gesamten Phänotyp wirken („globale Epistase“), als durch eine große Anzahl von Wechselwirkungen mit kleinen Effekten hoher Ordnung („idiosynkratische Epistase“). ). Unsere Implementierung ähnelt der von Sailer und Harms, 201743, beschriebenen und folgt eng Phillips und Lawrence et al., 202142. Kurz gesagt, wir verwenden eine logistische Funktion Φ mit vier Parametern, um den Ausdruck anzupassen:

Die Wahl einer Logistikfunktion wird durch die allgemeine Form der KD,app-Verteilung gerechtfertigt, die bei starkem KD,app ein leichtes „Plateau“ aufweist. Dieser Effekt wird nicht durch experimentelle Artefakte verursacht (ergänzende Abbildung 3), sondern durch eine Form der Epistase mit „verringernden Erträgen“43. In der Praxis werden die Parameter durch sukzessives Anpassen des additiven βi und der nichtlinearen Funktionsparameter abgeleitet. Obwohl die globale Epistase-Transformation die Anpassung verbessert, ändern sich die bei niedriger Ordnung beobachteten additiven Koeffizienten nicht wesentlich (ergänzende Abbildung 7).

Wir verwendeten die Referenzstruktur einer 2,79 Å großen Kryo-EM-Struktur von Omicron BA.1, komplexiert mit ACE2 (PDB-ID: 7WPB). In Abb. 2c wird die Kontaktoberfläche bestimmt, indem ChimeraX44 verwendet wird, um die vergrabene Oberfläche zwischen ACE2 und jedem mutierten Rest im RBD zu messen (Funktion für vergrabene Fläche messen, Standard-ProbeRadius von 1,4 Å). In Abb. 2E wird der Abstand zwischen α-Kohlenstoffen mit PyMol45 gemessen.

Die ACE2-Bindungsaffinität wirkt sich auf die Fitness von SARS-CoV-2-Varianten aus und kann daher genutzt werden, um teilweise Rückschlüsse auf deren vergangene Entwicklung zu ziehen. Diese Information ist besonders wichtig für Omicron BA.1, wo phylogenetische Informationen begrenzt sind. Da unser Datensatz die ACE2-Affinität aller möglichen evolutionären Zwischenprodukte enthält, können wir die Wahrscheinlichkeiten aller Pfade zwischen der angestammten Wuhan Hu-1-Sequenz und Omicron BA.1 ableiten. Dazu müssen wir ein Auswahlmodell auswählen. Die Umstände, unter denen sich die Omicron-Variante entwickelte, sind unbekannt, und die evolutionäre Fitness des Virus ist komplexer als seine Fähigkeit, ACE2 zu binden – neben vielen anderen Faktoren spielen auch Immundruck, strukturelle Stabilität und Expressionsniveau eine Rolle46. Darüber hinaus kommen Rückmutationen in der viralen Evolution häufig vor und der Selektionsdruck kann sich ändern, je nachdem, ob der Stamm schnell den Wirt wechselt oder Teil einer Langzeitinfektion ist. Hier haben wir uns für ein äußerst einfaches Regime der Virusentwicklung mit schwacher Mutation und starker Selektion entschieden.

In diesem Modell verläuft die Selektion als Markov-Prozess, bei dem die Population durch eine einzelne Sequenz gekennzeichnet ist, die bei jedem diskreten Schritt eine einzelne Mutation erwirbt31,47. Wir gehen davon aus, dass Rückmutationen (dh ein Restwechsel von der Wuhan-Hu-1-Aminosäure zur BA.1-Aminosäure) nicht möglich sind. Sobald eine solche Sequenz erzeugt ist, wird sie entweder in der gesamten Population verankert oder stirbt aus. Der wichtige Parameter ist dann die Fixierungswahrscheinlichkeit, die von der Bindungsaffinität sowohl der ursprünglichen als auch der mutierten Sequenzen abhängt. Wir entscheiden uns für die häufig verwendete klassische Fixierungswahrscheinlichkeit48 für eine Mutation mit dem Selektionskoeffizienten σ in einer Population der Größe N:

Hier ist der Selektionskoeffizient proportional zum Unterschied der logarithmischen Bindungsaffinitäten zwischen den beiden Sequenzen. Wir verwenden dieses Modell im Grenzwert der „starken Selektion“ (N → ∞ und σ → ∞), bei dem eine Mutation festlegt, ob sie vorteilhaft ist oder ob sie unter allen verbleibenden Mutationen die weniger schädliche Wahl ist. Schwächere Auswahlmodelle mit niedrigeren Werten für σ und N liefern qualitativ ähnliche Ergebnisse, sofern der Auswahldruck hoch genug ist (siehe ergänzende Abbildung 11b; bei ausreichend kleinen Auswahldrücken wird die Reihenfolge erwartungsgemäß zufällig). Um dieses Modell zu implementieren, verwenden wir einen Übergangsmatrix-Ansatz, der es uns ermöglicht, schnell die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass jeder Rest an einer bestimmten Position erscheint. Um zu überprüfen, ob die Reihenfolge spezifischer Mutationen statistisch signifikant ist, verwenden wir eine Bootstrap-Methode und entnehmen Affinitätswerte aus Normalverteilungen mit Mittelwert und Standardabweichung, die sich aus unseren experimentellen Messungen ergeben. Anschließend untersuchen wir Mutationen gemäß dem zuvor beschriebenen Modell und verwenden Standardmethoden, um die Signifikanz zu bestimmen.

Die hochdimensionale Bindungsaffinitätslandschaft kann mit einem kraftgesteuerten Graph-Layout-Ansatz in zwei Dimensionen projiziert werden (siehe https://desai-lab.github.io/wuhan_to_omicron/). Jede Sequenz in der Antikörperbibliothek ist ein Knoten, der durch Kanten mit seinen Nachbarn mit einer einzelnen Mutation verbunden ist. Eine Kante zwischen zwei Folgen s und t erhält das Gewicht:

In einer kraftgerichteten Darstellung stoßen sich Knoten gegenseitig ab, während die Kanten die Knoten, an denen sie befestigt sind, zusammenziehen. In unserem Szenario bedeutet dies, dass Knoten mit einem ähnlichen Genotyp (einige Mutationen voneinander entfernt) und einem ähnlichen Phänotyp (Bindungsaffinität) in zwei Dimensionen nahe beieinander liegen.

Wichtig ist, dass es sich hierbei nicht um eine „Querformat“-Darstellung handelt: Der Abstand zwischen zwei Punkten hat nichts damit zu tun, wie einfach es ist, in einem bestimmten Selektionsmodell einen Genotyp von einem anderen zu erreichen. Praktischerweise verwenden wir nach der Zuweisung aller Kantengewichte die Layoutfunktion „layout_drl“ aus dem Python-Paket iGraph mit Standardeinstellungen, um die Layoutkoordinaten für jede Variante zu erhalten.

Zur Analyse der SARS-CoV-2-Phylogenie (Abb. 4a, b) verwendeten wir alle vollständigen RBD-Sequenzen aus allen SARS-CoV-2-Genomen, die im Repository der Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID)49,50,51 hinterlegt sind GISAID Audacity globale Phylogenie (EPI_SET-ID: EPI_SET_20220615uq, verfügbar auf GISAID bis zum 15. Juni 2022 und zugänglich unter https://doi.org/10.55876/gis8.220615uq). Wir haben den Baum beschnitten, um alle Sequenzen mit RBD zu entfernen, die keinem der möglichen Zwischenprodukte zwischen Wuhan Hu-1 und Omicron BA.1 entsprechen, und diesen Baum mit dem Python-Toolkit ete352 analysiert. Wir haben die Häufigkeit jeder Mutation gemessen (Abb. 4a), indem wir gezählt haben, wie oft sie unabhängig im Baum auftritt (dh wie oft die Mutation auf einem Knoten auftritt, dessen Elternknoten diese Mutation nicht aufweist). Für Abb. 4b haben wir zwei Mutationen als gleichzeitig auftretend gezählt, wenn beide Mutationen im Elternknoten fehlen und in mindestens einem der Nachkommenknoten enthalten sind. Daher beschränken wir unseren Anwendungsbereich auf Mutationen, die im selben Zweig auftreten, anstatt Mutationen in allen Nachkommen zu berücksichtigen. Dadurch können wir die Auswirkungen von Lärm und Eventualitäten reduzieren. Beispielsweise wird eine neutrale Mutation, die früh in einer Abstammungslinie auftritt, viele Nachkommen haben, was ihren Einfluss verzerren könnte. Diese Strategie zur Untersuchung der relativen Häufigkeit gleichzeitig auftretender Mutationen ist ein spezifischer Fall der in Kryazhimskiy et al.47 entwickelten Methode, die aus phylogenetischen Daten auf Epistase zwischen Mutationen schließt (die allgemeine Methode war aufgrund ihrer Größe in diesem speziellen Datensatz nicht anwendbar).

Alle Datenverarbeitungen und statistischen Analysen wurden mit R v4.1.053 und Python 3.10.054 durchgeführt. Alle Abbildungen wurden mit ggplot255 und matplotlib56 generiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Rohsequenzierungslesungen wurden in der NCBI BioProject-Datenbank unter der Zugangsnummer PRJNA849979 hinterlegt. Das Github-Repository39 https://github.com/desai-lab/compensatory_epistasis_omicron/ enthält alle zugehörigen Metadaten („Titeseq/metadata“) und die Durchflusszytometrie-FCS-Dateien („Titeseq/facs_data“). Wir haben auch einen öffentlich verfügbaren Datensatz eines Drittanbieters von GISAID verwendet, der unter https://doi.org/10.55876/gis8.220615uq zugänglich ist.

Das Github-Repository39 https://github.com/desai-lab/compensatory_epistasis_omicron/Titeseq/ enthält alle zugehörigen Analysecodes.

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Wir danken Zach Niziolek für seine Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und den Mitgliedern des Desai-Labors für hilfreiche Diskussionen. TD dankt für die Unterstützung durch das Human Frontier Science Program Postdoctoral Fellowship, AMP dankt für die Unterstützung durch das Howard Hughes Medical Institute Hanna H. Gray Postdoctoral Fellowship, JC dankt für die Unterstützung durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship und MMD dankt für die Unterstützung durch das NSF-Simons Center für Mathematische und statistische Analyse der Biologie an der Harvard University, unterstützt durch NSF-Stipendium Nr. DMS-1764269 und die Harvard FAS Quantitative Biology Initiative gewähren PHY-1914916 von der NSF und GM104239 vom NIH. JDB dankt für die Unterstützung durch das NIH/NIAID-Stipendium R01AI141707 und ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute. Wir danken allen Datenlieferanten, d. h. den Autoren und ihren Ursprungslaboren, die für die Beschaffung der Proben verantwortlich sind, sowie ihren einreichenden Laboren für die Generierung der genetischen Sequenz und Metadaten und die Weitergabe über die GISAID-Initiative. Die Rechenarbeit wurde am FASRC Cannon-Cluster durchgeführt, der von der FAS Division of Science Research Computing Group der Harvard University unterstützt wurde.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Alief Moulana, Thomas Dupic, Angela M. Phillips, Jeffrey Chang.

Abteilung für Organismische und Evolutionsbiologie, Harvard University, Cambridge, MA, 02138, USA

Alief Moulana, Thomas Dupic, Angela M. Phillips und Michael M. Desai

Fachbereich Physik, Harvard University, Cambridge, MA, 02138, USA

Jeffrey Chang und Michael M. Desai

Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, Harvard University, Cambridge, MA, 02138, USA

Serafina Nieves

Biologische und biomedizinische Wissenschaften, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115, USA

Anne A. Roffler

Abteilung für Grundlagenwissenschaften und Computational Biology Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, 98109, USA

Allison J. Greaney, Tyler N. Starr und Jesse D. Bloom

Abteilung für Genomwissenschaften, University of Washington, Seattle, WA, 98195, USA

Allison J. Greaney und Jesse D. Bloom

Ausbildungsprogramm für medizinische Wissenschaftler, University of Washington, Seattle, WA, 98195, USA

Allison J. Greaney

Howard Hughes Medical Institute, Seattle, WA, 98109, USA

Jesse D. Bloom

NSF-Simons Center for Mathematical and Statistical Analysis of Biology, Harvard University, Cambridge, MA, 02138, USA

Michael M. Desai

Quantitative Biology Initiative, Harvard University, Cambridge, MA, 02138, USA

Michael M. Desai

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Konzeptualisierung: AM, TD, AMP, JC, TNS, AJG, JDB und MMD Methodik: AM, TD, AMP, JC, SN, TNS und AJG Bibliotheksdesign und -produktion: AM, TD, AMP, JC und AJG Experimente : AM, TD, AMP, JC und AAR Validierung: AM, TD, AMP, JC, SN und TNS Datenanalyse: AM, TD, AMP, JC, SN und TNS Überwachung: AMP, JDB und MMD Finanzierungsakquise : JDB- und MMD-Schreiben – Originalentwurf: AM, TD, AMP, JC und MMD Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Angela M. Phillips oder Michael M. Desai.

AMP und MMD haben oder haben sich kürzlich für Leyden Labs beraten. JDB war bzw. war kürzlich als Berater für Apriori Bio, Oncorus, Moderna und Merck tätig. JDB, AJG und TNS sind Erfinder der von Fred Hutch lizenzierten Patente im Zusammenhang mit dem viralen Deep-Mutational-Scanning. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Joachim Krug und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Moulana, A., Dupic, T., Phillips, AM et al. Die kompensatorische Epistase erhält die ACE2-Affinität bei SARS-CoV-2 Omicron BA.1 aufrecht. Nat Commun 13, 7011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34506-z

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Eingegangen: 08. September 2022

Angenommen: 26. Oktober 2022

Veröffentlicht: 16. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34506-z

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BMC Biologie (2023)

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