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Jan 03, 2024

De-novo-Design von Luciferasen mithilfe von Deep Learning

Naturband 614, Seiten

Nature Band 614, Seiten 774–780 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bei der Entwicklung von De-novo-Enzymen wurde versucht, aktive Stellen und Substratbindungstaschen einzuführen, von denen man annimmt, dass sie eine Reaktion von Interesse in geometrisch kompatiblen nativen Gerüsten katalysieren1,2, dies wurde jedoch durch den Mangel an geeigneten Proteinstrukturen und die Komplexität der nativen Proteinsequenz eingeschränkt – Beziehungen strukturieren. Hier beschreiben wir einen Deep-Learning-basierten Ansatz zur „familienweiten Halluzination“, der eine große Anzahl idealisierter Proteinstrukturen generiert, die verschiedene Taschenformen und entworfene Sequenzen enthalten, die diese kodieren. Wir verwenden diese Gerüste, um künstliche Luciferasen zu entwerfen, die selektiv die oxidative Chemilumineszenz der synthetischen Luciferin-Substrate Diphenylterazin3 und 2-Desoxycoelenterazin katalysieren. Die entworfenen aktiven Zentren positionieren eine Arginin-Guanidinium-Gruppe neben einem Anion, das sich während der Reaktion in einer Bindungstasche mit hoher Formkomplementarität entwickelt. Für beide Luciferin-Substrate erhalten wir entworfene Luciferasen mit hoher Selektivität; Das aktivste davon ist ein kleines (13,9 kDa) und thermostabiles (mit einer Schmelztemperatur von mehr als 95 °C) Enzym, dessen katalytische Effizienz auf Diphenylterazin (kcat/Km = 106 M−1 s−1) vergleichbar mit der von ist native Luciferasen, aber eine viel höhere Substratspezifität. Die Schaffung hochaktiver und spezifischer Biokatalysatoren von Grund auf mit breiten Anwendungen in der Biomedizin ist ein wichtiger Meilenstein für das computergestützte Enzymdesign, und unser Ansatz sollte die Erzeugung einer breiten Palette von Luciferasen und anderen Enzymen ermöglichen.

Biolumineszentes Licht, das durch die enzymatische Oxidation eines Luciferinsubstrats durch Luciferasen erzeugt wird, wird häufig für Bioassays und Bildgebung in der biomedizinischen Forschung verwendet. Da keine Anregungslichtquelle erforderlich ist, werden im Dunkeln lumineszierende Photonen erzeugt; Dies führt zu einer höheren Empfindlichkeit als die Fluoreszenzbildgebung in lebenden Tiermodellen und in biologischen Proben, bei denen Autofluoreszenz oder Phototoxizität ein Problem darstellen4,5. Die Entwicklung von Luciferasen als molekulare Sonden ist jedoch aus mehreren Gründen hinter der von gut entwickelten fluoreszierenden Protein-Toolkits zurückgeblieben: (i) Es wurden nur sehr wenige native Luciferasen identifiziert6,7; (ii) viele der identifizierten Zellen benötigen mehrere Disulfidbindungen zur Stabilisierung der Struktur und neigen daher zu Fehlfaltungen in Säugetierzellen8; (iii) die meisten nativen Luciferasen erkennen keine synthetischen Luciferine mit wünschenswerteren photophysikalischen Eigenschaften9; und (iv) Multiplex-Bildgebung zur parallelen Verfolgung mehrerer Prozesse unter Verwendung zueinander orthogonaler Luciferase-Luciferin-Paare wurde durch die geringe Substratspezifität nativer Luciferasen eingeschränkt10,11.

Wir wollten mithilfe des De-novo-Proteindesigns Luciferasen schaffen, die klein, hochstabil, gut in Zellen exprimiert, spezifisch für ein Substrat sind und für ihre Funktion keine Cofaktoren benötigen. Wir wählten ein synthetisches Luciferin, Diphenylterazin (DTZ), als Zielsubstrat aufgrund seiner hohen Quantenausbeute, seiner rotverschobenen Emission3, seiner günstigen In-vivo-Pharmakokinetik12,13 und dem Fehlen der für die Lichtemission erforderlichen Cofaktoren. Frühere rechnergestützte Enzymdesign-Bemühungen haben hauptsächlich native Proteingerüste in der Proteindatenbank (PDB)1,2 umfunktioniert, es gibt jedoch nur wenige native Strukturen mit für DTZ geeigneten Bindungstaschen, und die Auswirkungen von Sequenzänderungen auf native Proteine ​​können unvorhersehbar sein (entworfen). Helikale Bündel wurden auch als Enzymgerüste verwendet14,15,16, aber diese sind in ihrer Anzahl begrenzt und die meisten haben keine Taschen, die für die DTZ-Bindung geeignet sind. Um diese Einschränkungen zu umgehen, haben wir uns vorgenommen, eine große Anzahl kleiner und stabiler Proteingerüste mit Taschen in der für DTZ geeigneten Größe und Form und mit klaren Sequenz-Struktur-Beziehungen zu erzeugen, um den anschließenden Einbau des aktiven Zentrums zu erleichtern. Um Proteinfalten zu identifizieren, die solche Taschen beherbergen können, haben wir DTZ zunächst an 4.000 native, kleine Moleküle bindende Proteine ​​angedockt. Wir fanden heraus, dass viele Faltungen, die dem Kerntransportfaktor 2 (NTF2) ähneln, Bindungstaschen mit geeigneter Formkomplementarität und Größe für die DTZ-Platzierung aufweisen (rosa Striche in Abb. 1e) und haben daher die NTF2-ähnliche Superfamilie als Zieltopologie ausgewählt.

a, Familienweite Halluzination. Sequenzen, die Proteine ​​mit der gewünschten Topologie kodieren, werden durch Markov-Ketten-Monte-Carlo-Probenahme (MCMC) mit einer Mehrkomponenten-Verlustfunktion optimiert. Strukturell konservierte Regionen (Pfirsich) werden auf der Grundlage der Konsistenz mit eingegebenen Rest-Rest-Abstands- und Orientierungsverteilungen bewertet, die aus 85 experimentellen Strukturen von NTF2-ähnlichen Proteinen erhalten wurden, während variable nicht ideale Regionen (Blaugrün) auf der Grundlage der Konfidenz bewertet werden der vorhergesagten Geometrien zwischen Resten, berechnet als KL-Divergenz zwischen Netzwerkvorhersagen und der Hintergrundverteilung. Die Sequenzraum-MCMC-Probenahme umfasst sowohl Sequenzänderungen als auch Einfügungen und Löschungen (siehe ergänzende Methoden), um die halluzinierte Sequenz in Richtung der Codierung von Strukturen mit den gewünschten Falten zu leiten. Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke werden in die entworfenen Strukturen integriert, um die Strukturspezifität zu erhöhen. b–d, Das Design der aktiven Zentren der Luciferase. b, Erzeugung von Luciferase-Substrat(DTZ)-Konformeren. c, Erzeugung eines Rotamer-Wechselwirkungsfeldes (RIF) zur Stabilisierung von anionischem DTZ und zur Bildung hydrophober Packungswechselwirkungen. d, Andocken des RIF an die halluzinierten Gerüste und Optimierung der Substrat-Gerüst-Wechselwirkungen mithilfe eines auf Positionsspezifischen Score-Matrizen (PSSM) basierenden Sequenzdesigns. e, Auswahl der NTF2-Topologie. Der RIF wurde an 4.000 native, kleine Moleküle bindende Proteine ​​angedockt, mit Ausnahme von Proteinen, die das Luciferin-Substrat über mehr als fünf Schleifenreste binden. Die meisten Top-Hits stammten aus der NTF2-ähnlichen Protein-Superfamilie (rosa Striche). Unter Verwendung des familienweiten Protokolls zur Generierung von Halluzinationsgerüsten haben wir 1.615 Gerüste generiert und festgestellt, dass diese besser vorhergesagte RIF-Bindungsenergien lieferten als die nativen Proteine. f,g, Unsere DL-optimierten Gerüste proben mehr im Raum der nativen Strukturen (f) und haben stärkere Sequenz-zu-Struktur-Beziehungen (zuverlässigere Alphafold2-Strukturvorhersagen) (g) als native oder frühere Nicht-Deep-Learning-Energie -optimierte Gerüste.

Native NTF2-Strukturen haben eine Reihe von Taschengrößen und -formen, weisen aber auch nicht ideale Merkmale auf, wie z. B. lange Schlaufen, die die Stabilität beeinträchtigen. Um eine große Anzahl idealer NTF2-ähnlicher Strukturen zu erstellen, haben wir einen Deep-Learning-basierten Ansatz zur „familienweiten Halluzination“ entwickelt, der uneingeschränktes De-novo-Design17,18 und Rosetta-Sequenzdesign-Ansätze19 integriert, um die Generierung einer im Wesentlichen unbegrenzten Anzahl von Strukturen zu ermöglichen Proteine, die eine gewünschte Faltung aufweisen (Abb. 1a). Der familienweite Halluzinationsansatz nutzte die De-novo-Sequenz- und Strukturerkennungsfähigkeit der uneingeschränkten Proteinhalluzination17,18 für Schleifen- und variable Regionen sowie eine strukturgesteuerte Sequenzoptimierung für Kernregionen. Wir haben das neuronale Netzwerk zur Strukturvorhersage trRosetta20 verwendet, das bei der Identifizierung experimentell erfolgreicher De-novo-entworfener Proteine ​​und bei der Halluzination neuer globulärer Proteine ​​unterschiedlicher Topologien wirksam ist. Ausgehend von den Sequenzen von 2.000 natürlich vorkommenden NTF2s führten wir Monte-Carlo-Suchen im Sequenzraum durch, wobei wir bei jedem Schritt eine Sequenzänderung vornahmen und die Struktur mithilfe von trRosetta vorhersagten. Als leitende Suche nach Verlustfunktionen verwendeten wir das Vertrauen des neuronalen Netzwerks in die vorhergesagte Struktur (wie in unserer vorherigen Studie zur freien Halluzination), ergänzt durch eine topologiespezifische Verlustfunktion über Kernrestpaargeometrien (siehe ergänzende Methoden). In den Schleifenregionen ließen wir auch die Anzahl der Reste variieren, was zu kurzen, nahezu idealen Schleifen führte. Um die strukturelle Spezifität weiter zu kodieren, haben wir vergrabene, weitreichende Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke eingebaut. Die resultierenden 1.615 familienweit halluzinierten NTF2-Gerüste stellten mehr formkomplementäre Bindungstaschen für DTZ bereit als native, kleine Moleküle bindende Proteine ​​(Abb. 1e). Mit dieser Methode werden Proteinrückgrate abgetastet, die näher an nativen NTF2-ähnlichen Proteinen liegen (Abb. 1f) und bessere Gerüstqualitätsmetriken aufweisen als diejenigen, die in einem früheren energiebasierten Ansatz ohne Deep-Learning21 erzeugt wurden (Abb. 1g).

Das computergestützte Enzymdesign geht im Allgemeinen von einem idealen aktiven Zentrum oder Theozym aus, das aus funktionellen Proteingruppen besteht, die den Reaktionsübergangszustand umgeben und dann in einen Satz vorhandener Gerüste eingepasst werden1,2. Die detaillierte katalytische Geometrie nativer mariner Luciferasen ist jedoch nicht gut verstanden, da (zum Zeitpunkt dieser Studie) nur eine Handvoll Apo-Strukturen und keine Holo-Strukturen mit Luciferin-Substraten gelöst wurden22,23,24. Sowohl quantenchemische Berechnungen25,26 als auch experimentelle Daten27,28 deuten darauf hin, dass die Chemilumineszenzreaktion über eine anionische Spezies verläuft und dass die Polarität der Umgebung die freie Energie des anschließenden Einzelelektronentransferprozesses (SET) mit molekularem Triplettsauerstoff erheblich verändern kann ( 3O2). Basierend auf diesen Daten (Extended Data Abb. 1) versuchten wir, eine formkomplementäre katalytische Stelle zu entwerfen, die den anionischen Zustand von DTZ stabilisiert und die SET-Energiebarriere senkt, unter der Annahme, dass die nachgeschalteten Dioxetan-Lichtemitter-Thermolyseschritte spontan erfolgen. Um den anionischen Zustand zu stabilisieren, konzentrierten wir uns auf die Platzierung der positiv geladenen Guanidiniumgruppe eines Argininrests, um die sich entwickelnde negative Ladung an der Imidazopyrazinongruppe zu stabilisieren.

Um solche aktiven Zentren rechnerisch in eine große Anzahl halluzinierter NTF2-Gerüste zu integrieren, haben wir zunächst ein Ensemble anionischer DTZ-Konformere generiert (Abb. 1b). Als nächstes verwendeten wir um jedes Konformer herum die RifGen-Methode29,30, um Rotamer-Interaktionsfelder (RIFs) auf dreidimensionalen Gittern aufzuzählen, die aus Millionen von Platzierungen von Aminosäureseitenketten bestehen, die Wasserstoffbrückenbindungen und unpolare Wechselwirkungen mit DTZ bilden (Abb. 1c). . Eine Arginin-Guanidinium-Gruppe wurde neben dem N1-Atom der Imidazopyrazinon-Gruppe platziert, um die negative Ladung zu stabilisieren. Anschließend wurde RifDock verwendet, um jedes DTZ-Konformer und das zugehörige RIF im zentralen Hohlraum jedes Gerüsts anzudocken, um die Protein-DTZ-Wechselwirkungen zu maximieren. In jeder Tasche befanden sich durchschnittlich acht Seitenkettenrotamere, einschließlich eines Argininrests zur Stabilisierung des anionischen Imidazopyrazinon-Kerns (ergänzende Abbildung 2a). Für die Top 50.000 Docks mit den günstigsten Seitenketten-DTZ-Wechselwirkungen haben wir den Rest der Sequenz mit RosettaDesign (Abb. 1d) für eine hochaffine Bindung an DTZ optimiert, wobei die natürlich beobachtete Sequenzvariation zur Gewährleistung der Faltbarkeit im Vordergrund stand. Während des Entwurfsprozesses wurden vordefinierte Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke (HBNets) in den Gerüsten aus Gründen der Strukturspezifität und Stabilität intakt gehalten, und Wechselwirkungen dieser HBNet-Seitenketten mit DTZ waren im RifDock-Schritt ausdrücklich erforderlich, um die Vororganisation der Reste sicherzustellen sind für die Katalyse unerlässlich. Im ersten Schritt des Sequenzdesigns wurden die Identitäten aller RIF- und HBNet-Reste beibehalten und die umgebenden Reste optimiert, um die Seitenketten-DTZ-Wechselwirkungen aufrechtzuerhalten und die strukturelle Spezifität aufrechtzuerhalten. Im zweiten Schritt des Sequenzdesigns durften auch die Identitäten der RIF-Reste (außer Arginin) variieren, da Rosetta apolare und aromatische Packungswechselwirkungen identifizieren kann, die im RIF aufgrund von Binning-Effekten übersehen wurden. Während des Sequenzdesigns durften sich das Gerüstrückgrat, die Seitenketten und das DTZ-Substrat im kartesischen Raum entspannen. Nach der Sequenzoptimierung wurden die Designs auf der Grundlage von Ligandenbindungsenergie, Protein-Ligand-Wasserstoffbrückenbindungen, Formkomplementarität und Kontaktmoleküloberfläche gefiltert und 7.648 Designs ausgewählt und als gepoolte Oligos für das experimentelle Screening bestellt.

Oligonukleotide, die die beiden Hälften jedes Designs kodieren, wurden zu Genen voller Länge zusammengesetzt und in einen Escherichia coli-Expressionsvektor kloniert (siehe ergänzende Methoden). Eine koloniebasierte Screening-Methode wurde verwendet, um aktive Luciferase-Kolonien aus der Bibliothek direkt abzubilden, und die Aktivitäten ausgewählter Klone wurden mithilfe einer 96-Well-Plattenexpression bestätigt (Extended Data, Abb. 2). Drei aktive Designs wurden identifiziert; Wir bezeichnen die aktivste davon als LuxSit (von lateinisch lux sit, „Licht existieren lassen“), die unseres Wissens nach mit 117 Resten (13,9 kDa) kleiner ist als jede zuvor beschriebene Luciferase. Biochemische Analysen, einschließlich SDS-PAGE und Größenausschlusschromatographie (Abb. 2a, b und Extended Data Abb. 3), zeigten, dass LuxSit in E. coli stark exprimiert wird, löslich und monomer ist. Die Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) zeigte eine starke CD-Signatur im fernen Ultraviolett, was auf eine organisierte α-β-Struktur schließen lässt. CD-Schmelzexperimente zeigten, dass das Protein bei 95 °C nicht vollständig entfaltet ist und dass die volle Struktur wiedererlangt wird, wenn die Temperatur gesenkt wird (Abb. 2c). Die Inkubation von LuxSit mit DTZ führte zu einer Lumineszenz mit einem Emissionspeak bei etwa 480 nm (Abb. 2d), was mit dem DTZ-Chemilumineszenzspektrum übereinstimmt. Obwohl wir die Kristallstruktur von LuxSit nicht bestimmen konnten, kommt die von AlphaFold2 (Lit. 31) vorhergesagte Struktur dem Designmodell auf Grundgerüstebene (Root-Mean-Square-Abweichung (RMSD) = 1,35 Å) und darüber sehr nahe Die Seitenketten interagieren mit dem Substrat (Abb. 2e). Das entworfene aktive LuxSit-Zentrum enthält Tyr14-His98- und Asp18-Arg65-Dyaden, wobei die Imidazol-Stickstoffatome von His98 Wasserstoffbrückenbindungen mit Tyr14 und dem O1-Atom von DTZ eingehen (Abb. 2f). Das Zentrum des Guanidiniumkations Arg65 liegt 4,2 Å vom N1-Atom von DTZ entfernt und Asp18 bildet eine zweizähnige Wasserstoffbrücke zur Guanidiniumgruppe und dem N-H-Rückgrat von Arg65 (Abb. 2g).

a, Coomassie-gefärbte SDS-PAGE von gereinigtem rekombinantem LuxSit aus E. coli (Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1). b: Die Größenausschlusschromatographie von gereinigtem LuxSit lässt auf monodisperse und monomere Eigenschaften schließen. c, CD-Spektren im fernen Ultraviolett bei 25 °C (schwarz), 95 °C (rot) und wieder abgekühlt auf 25 °C (grün). Einschub, CD-Schmelzkurve von LuxSit bei 220 nm. MRE, molare Restelliptizität. d, Lumineszenzemissionsspektren von DTZ in Gegenwart (blau) und Abwesenheit (grün) von LuxSit. e, Strukturelle Ausrichtung des Designmodells (blau) und des von AlphaFold2 vorhergesagten Modells (grau), die sowohl auf der Ebene des Rückgrats (links) als auch der Seitenkette (rechts) gut übereinstimmen. f–i, Standortsättigungsmutagenese substratinteragierender Reste. Vergrößerte Ansichten (links) der entworfenen (blau) und AlphaFold2-Modelle (grau) auf Seitenkettenebene, die die entworfenen Enzym-Substrat-Wechselwirkungen von Tyr14–His98-Kern-HBNet (f), Asp18–Arg65-Dyade (g), π- Stapelungsreste (h) und hydrophobe Packungsreste (i). Sequenzprofile (rechts) werden anhand der Aktivitäten verschiedener Sequenzvarianten skaliert: (Aktivität für die angegebene Aminosäure)/(Summe der Aktivitäten über alle getesteten Aminosäuren an der angegebenen Position). A96M- und M110V-Substitutionen mit erhöhter Aktivität sind rosa hervorgehoben.

Quelldaten

Als nächstes versuchten wir, die Erkenntnisse aus der Entwicklung von LuxSit anzuwenden, um 2-Desoxycoelenterazin (h-CTZ)-spezifische Luciferasen zu entwickeln. Da sich die Molekülform von h-CTZ von der von DTZ unterscheidet, haben wir einen zusätzlichen Satz von Gerüsten der NTF2-Superfamilie (siehe ergänzende Methoden) mit passenden Taschenformen und hoher Modellzuverlässigkeit erstellt (AlphaFold2-vorhergesagter lokaler Distanzdifferenztest (pLDDT) >). 92). Anschließend installierten wir katalytische Stellen in diesen Gerüsten und entwarfen die ersten Wechselwirkungen zwischen Hüllenprotein-Seitenkette und h-CTZ unter Verwendung der Histidin- und Arginin-Substrat-Wechselwirkungsgeometrien, die in der ersten Runde für DTZ am erfolgreichsten waren. Um den Rest der Sequenz zu entwerfen, haben wir ProteinMPNN32 verwendet, das zu einer besseren Stabilität, Löslichkeit und Genauigkeit als RosettaDesign führen kann. Nach der Filterung auf der Grundlage der von AlphaFold2 vorhergesagten pLDDT-, Cα-RMSD-, Kontaktmoleküloberflächen- und Rosetta-berechneten Bindungsenergien (siehe ergänzende Methoden) haben wir 46 Designs in E. coli ausgewählt und experimentell ausgedrückt und 2 (HTZ3-D2 und HTZ3) identifiziert -G4), die Luciferase-Aktivität mit dem h-CTZ-Luciferin-Substrat aufwies. Beide Designs waren gut löslich, monodispers und monomer, und die Luciferase-Aktivitäten lagen in der gleichen Größenordnung wie bei LuxSit (Erweiterte Daten, Abb. 4). Die Erfolgsquote stieg in der zweiten Runde von 3/7.648 auf 2/46 Sequenzen, wahrscheinlich aufgrund der Kenntnis der Geometrie des aktiven Zentrums aus der ersten Runde und der erhöhten Robustheit der ProteinMPNN-Methode des Sequenzdesigns.

Um die Beiträge zur Katalyse von LuxSit, dem aktivsten unserer Designs, besser zu verstehen, haben wir eine Site-Saturation-Mutagenesis (SSM)-Bibliothek erstellt, in der jeder Rest in der Substratbindungstasche einzeln zu jeder anderen Aminosäure mutiert wurde (siehe Ergänzende Methoden) und bestimmte die Auswirkung jeder Mutation auf die Luciferase-Aktivität. Abbildung 2f–i zeigt die Aminosäurepräferenzen an Schlüsselpositionen. Arg65 ist hoch konserviert (Abb. 2g) und sein Dyadenpartner Asp18 kann nur zu Glu mutiert werden (was die Aktivität verringert), was darauf hindeutet, dass die Carboxylat-Arg65-Wasserstoffbindung für die Luciferase-Aktivität wichtig ist. In der Tyr14-His98-Dyade (Abb. 2f) kann Tyr14 durch Asp und Glu und His98 durch Asn ersetzt werden. Da alle aktiven Varianten an diesen Positionen über Wasserstoffbrückendonoren und -akzeptoren verfügten, könnten die Dyaden dabei helfen, den für die Lumineszenz erforderlichen Elektronen- und Protonentransfer zu vermitteln. Hydrophobe (Abb. 2i) und π-stapelnde (Abb. 2h) Reste an der Bindungsschnittstelle tolerieren andere aromatische oder aliphatische Substitutionen und bevorzugen im Allgemeinen die Aminosäure im ursprünglichen Design, was mit modellbasierten Affinitätsvorhersagen von Mutationseffekten übereinstimmt (Erweiterte Daten). Abb. 5). Die A96M- und M110V-Mutanten (rosa hervorgehoben) erhöhen die Aktivität gegenüber LuxSit um das 16- bzw. 19-fache (Ergänzungstabelle 1). Die auf diesen Ergebnissen basierende Optimierung ergab LuxSit-f (A96M/M110V) mit einer Emissionskinetik vom Blitztyp und LuxSit-i (R60S/A96L/M110V) mit einem Photonenfluss, der mehr als 100-fach höher als der von LuxSit ist ( Erweiterte Daten Abb. 6). Insgesamt stützen die Ergebnisse der Sättigungsmutagenese im aktiven Zentrum das Designmodell, wobei die Tyr14-His98- und Asp18-Arg65-Dyaden eine Schlüsselrolle bei der Katalyse spielen und die Substratbindungstasche weitgehend konserviert ist.

Die aktivsten Katalysatoren, LuxSit-i (Erweiterte Daten, Abb. 3b, e, h) und LuxSit-f (Erweiterte Daten, Abb. 3c, f, i), wurden beide in hohen Konzentrationen löslich in E. coli exprimiert und sind monomer ( Bei der hohen Proteinkonzentration wurde eine gewisse Dimerisierung beobachtet (Extended Data Abb. 3l) und thermostabil (Extended Data Abb. 3j, k). Ähnlich wie bei nativen Luciferasen, die CTZ verwenden, liegen die scheinbaren Michaelis-Konstanten (Km) von LuxSit-i und LuxSit-f im niedrigen mikromolaren Bereich (Abb. 3a) und das Lumineszenzsignal nimmt aufgrund des schnellen katalytischen Umsatzes mit der Zeit ab (Erweitert). Daten Abb. 7a). LuxSit-i ist ein sehr effizientes Enzym mit einer katalytischen Effizienz (kcat/Km) von 106 M−1 s−1. Das Lumineszenzsignal ist mit bloßem Auge gut sichtbar (Abb. 3b) und der Photonenfluss (Photonen pro Sekunde) ist 38 % größer als der der nativen Renilla reniformis-Luciferase (RLuc) (Ergänzungstabelle 2). Die durch LuxSit-i katalysierte DTZ-Lumineszenzreaktion ist pH-abhängig (Extended Data Abb. 7b), was mit dem vorgeschlagenen Mechanismus übereinstimmt. Wir verwendeten eine Kombination aus Berechnungen der Dichtefunktionaltheorie (DFT) und Simulationen der Molekulardynamik (MD), um die Grundlage für die LuxSit-Aktivität detaillierter zu untersuchen. Die Ergebnisse stützen den Anionenstabilisierungsmechanismus (Erweiterte Daten, Abb. 8a und Ergänzende Abb. 3a) und legen nahe, dass LuxSit-i eine bessere Ladungsstabilisierung des DTZ-Übergangszustands bietet als LuxSit (Erweiterte Daten, Abb. 8b).

a, Substratkonzentrationsabhängigkeit der LuxSit-, LuxSit-f- und LuxSit-i-Aktivität. Die Zahlen geben das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis (S/N) bei Vmax (Photon s−1 Molekül−1) an. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3). b: Lumineszenzbilder, aufgenommen mit einem BioRad Imager (oben) oder einer Apple iPhone 8-Kamera (unten). Röhren von links nach rechts: nur DTZ; DTZ plus 100 nM gereinigtes LuxSit; und DTZ plus 100 nM gereinigtes LuxSit-i, was die hohe Effizienz der Photonenproduktion zeigt. c, Fluoreszenz- und Lumineszenzmikroskopische Bilder lebender HEK293T-Zellen, die vorübergehend LuxSit-i-mTagBFP2 exprimieren; LuxSit-i-Aktivität kann mit Einzelzellenauflösung erfasst werden. Links: Fluoreszenzkanal, der das mTagBFP2-Signal darstellt. Rechts wurden die gesamten Lumineszenzphotonen während einer 10-sekündigen Belichtung ohne Anregungslicht unmittelbar nach Zugabe von 25 µM DTZ gesammelt. Einsätze, Negativkontrolle, nicht transfizierte Zellen mit DTZ. Maßstabsbalken, 20 μm; 40-fache Vergrößerung.

Quelldaten

Da Luciferasen häufig als genetische Markierungen und Reporter für zellbiologische Studien verwendet werden, haben wir die Expression und Funktion von LuxSit-i in lebenden Säugetierzellen untersucht. HEK293T-Zellen, die LuxSit-i-mTagBFP2 exprimierten, zeigten DTZ-spezifische Lumineszenz (Abb. 3c), die nach dem Targeting von LuxSit-i-mTagBFP2 auf den Kern, die Membran und die Mitochondrien erhalten blieb (Extended Data Abb. 9). Native und zuvor manipulierte Luciferasen sind ziemlich promiskuitiv und auf vielen Luciferin-Substraten aktiv (Abb. 4ac und ergänzende Abb. 4); Dies ist möglicherweise auf ihre großen und offenen Taschen zurückzuführen (eine Luciferase mit hoher Spezifität für ein Luciferin-Substrat war selbst bei umfassender gerichteter Evolution schwer zu kontrollieren33,34). Im Gegensatz dazu zeigte LuxSit-i eine hervorragende Spezifität für sein Ziel-Luciferin mit einer 50-fachen Selektivität für DTZ gegenüber Bis-CTZ (das sich nur in einem benzylischen Kohlenstoff unterscheidet; MD-Simulationen legen nahe, dass dies auf eine größere Komplementarität der Übergangszustandsform zurückzuführen ist (Extended Data). Abb. 8b, c und ergänzende Abb. 3b, c)), 28-fache Selektivität gegenüber 8pyDTZ (unterscheidet sich nur in einem Stickstoffatom) und mehr als 100-fache Selektivität gegenüber anderen Luciferin-Substraten (Abb. 4b). Eines unserer aktiven Designs für h-CTZ (HTZ3-G4) war auch sehr spezifisch für sein Zielsubstrat (Abb. 4c und erweiterte Daten Abb. 4d). Insgesamt ist die Spezifität unserer entwickelten Luciferasen viel größer als die nativer Luciferasen 35, 36 oder zuvor manipulierter Luciferasen 37 (Ergänzungstabelle 5).

a, Chemische Strukturen von Coelenterazin-Substratanaloga. b, Normalisierte Aktivität von LuxSit-i auf ausgewählten Luciferin-Substraten. Lumineszenzbild (oben) und Signalquantifizierung (unten) des angegebenen Substrats in Gegenwart von 100 nM LuxSit-i. LuxSit-i weist eine hohe Spezifität für das Design-Zielsubstrat DTZ auf. c, Heatmap-Visualisierung der Substratspezifität von LuxSit-i; Renilla-Luciferase (RLuc); Gaussia-Luciferase (GLuc); konstruierte NLuc aus Oplophorus-Luciferase; und die für h-CTZ entwickelte De-novo-Luciferase (HTZ3-G4). Die Wärmekarte zeigt die Lumineszenz für jedes Enzym auf jedem Substrat; Die Werte werden pro Enzym auf das höchste Signal für dieses Enzym über alle Substrate normiert. d, Das Lumineszenzemissionsspektrum von LuxSit-i-DTZ (grün) und RLuc-PP-CTZ (lila) kann durch 528/20- und 390/35-Filter (dargestellt in gestrichelten Balken) spektral aufgelöst werden und erkennt nur das verwandte Substrat. e, Schema des Multiplex-Luciferase-Assays. HEK293T-Zellen, die vorübergehend mit CRE-RLuc-, NF-κB-LuxSit-i- und CMV-CyOFP-Plasmiden transfiziert wurden, wurden entweder mit Forskolin (FSK) oder humanem Tumornekrosefaktor (TNF) behandelt, um die Expression markierter Luciferasen zu induzieren. f,g, Lumineszenzsignale von Zellen können mit einem Plattenlesegerät entweder mit substrataufgelösten oder spektralaufgelösten Methoden gemessen werden. f: Für die substrataufgelöste Methode wurde die Lumineszenzintensität ohne Filter nach Zugabe von entweder PP-CTZ oder DTZ aufgezeichnet. g: Für die spektral aufgelöste Methode wurden sowohl PP-CTZ als auch DTZ hinzugefügt und die Signale wurden gleichzeitig mit 528/20- und 390/35-Filtern erfasst. In f und g zeigt das untere Feld die Zugabe von FSK oder TNF an. Lumineszenzsignale wurden aus dem Lysat von 15.000 Zellen im CelLytic M-Reagenz erfasst und das CyOFP-Fluoreszenzsignal wurde zur Normalisierung der Zellzahlen und Transfektionseffizienzen verwendet. Alle Daten wurden auf die entsprechende nicht stimulierte Kontrolle normalisiert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3).

Quelldaten

Wir kamen zu dem Schluss, dass die hohe Substratspezifität von LuxSit-i das Multiplexen von Lumineszenzreportern durch substratspezifische oder spektral aufgelöste Lumineszenzsignale ermöglichen könnte (Abb. 4d und erweiterte Daten Abb. 10a, b). Um diese Möglichkeit zu untersuchen, platzierten wir LuxSit-i stromabwärts des NF-κB-Antwortelements und RLuc stromabwärts des cAMP-Antwortelements (Abb. 4e). Die Zugabe von Aktivatoren (TNF) des NF-κB-Signalwegs führte zu Lumineszenz, wenn die Zellen mit DTZ inkubiert wurden, während die Lumineszenz von PP-CTZ (dem Substrat von RLuc) nur beobachtet wurde, wenn der cAMP-PKA-Signalweg aktiviert wurde (Abb . 4f). Da DTZ und PP-CTZ Lumineszenz bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, können sie grundsätzlich kombiniert und die beiden Signale durch Spektralanalyse entfaltet werden. Tatsächlich beobachteten wir, dass die Aktivierung des NF-κB-Signals zu Lumineszenz bei der DTZ-Wellenlänge führte, während die Zugabe von cAMP-PKA-Signalwegaktivatoren (FSK) Lumineszenz bei der PP-CTZ-Wellenlänge erzeugte, was es uns ermöglichte, die Aktivierung beider gleichzeitig zu bewerten Signalwege in derselben Probe entweder mit Zelllysaten (Abb. 4g) oder intakten HEK293T-Zellen (Extended Data Abb. 10c–e), indem beide Substrate zusammen bereitgestellt werden. Somit ermöglicht die hohe Substratspezifität von LuxSit-i die Multiplex-Berichterstattung über verschiedene zelluläre Reaktionen.

Das computergestützte Enzymdesign wurde durch die Anzahl der verfügbaren Gerüste eingeschränkt, was das Ausmaß einschränkt, in dem katalytische Konfigurationen und die Komplementarität der Enzym-Substrat-Form erreicht werden können14,15,16. Der Einsatz von Deep Learning zur Herstellung einer großen Anzahl von De-novo-entworfenen Gerüsten beseitigt hier diese Einschränkung, und die genaueren Modelle RoseTTAfold (Ref. 38) und AlphaFold2 (Ref. 31) sollten eine noch effektivere Generierung von Proteingerüsten durch Familien ermöglichen -weite Halluzination und andere Ansätze18,39. Die Vielfalt an Formen und Größen von Gerüsttaschen ermöglichte es uns, eine Reihe katalytischer Geometrien zu berücksichtigen und die Komplementarität zwischen Reaktionszwischenprodukt und Enzymform zu maximieren. Unseres Wissens nach weisen keine nativen Luciferasen Falten auf, die denen von LuxSit ähneln, und das Enzym weist eine hohe Spezifität für ein vollständig synthetisches Luciferinsubstrat auf, das in der Natur nicht vorkommt. Durch den Einbau von drei Substitutionen, die eine komplementärere Tasche zur Stabilisierung des Übergangszustands bereitstellen, weist LuxSit-i mit einem kcat/Km (106 M−1 s−1) eine höhere Aktivität als jedes zuvor de novo entwickelte Enzym auf Reihe nativer Luciferasen. Dies ist ein bemerkenswerter Fortschritt für das rechnergestützte Enzymdesign, da Dutzende Runden gerichteter Evolution erforderlich waren, um katalytische Effizienzen in diesem Bereich für eine entworfene Retroaldolase zu erreichen, und die Struktur erheblich umgestaltet wurde40; Im Gegensatz dazu sind die vorhergesagten Unterschiede in den Ligand-Seitenketten-Wechselwirkungen zwischen LuxSit und LuxSit-i sehr subtil (ergänzende Abbildung 2b; das Erreichen solch hoher Aktivitäten direkt vom Computer aus bleibt eine Herausforderung beim rechnergestützten Enzymdesign). Die geringe Größe, Stabilität und robuste Faltung von LuxSit-i machen es gut geeignet für Luciferase-Fusionen an Proteine ​​von Interesse und als genetische Markierung für virale Vektoren mit begrenzter Kapazität. Was die Grundlagenforschung betrifft, machen die geringe Größe, Einfachheit und hohe Aktivität von LuxSit-i es zu einem hervorragenden Modellsystem für rechnerische und experimentelle Studien des katalytischen Mechanismus der Luciferase. Die Ausweitung des hier verwendeten Ansatzes zur Schaffung ähnlich spezifischer Luciferasen für synthetische Luciferin-Substrate über DTZ und h-CTZ hinaus würde die in Abb. 4 dargestellten Multiplexing-Möglichkeiten erheblich erweitern (insbesondere angesichts der jüngsten Fortschritte in der Mikroskopie41) und eine neue Generation von Multiplex-Lumineszenz-Toolkits ermöglichen . Allgemeiner gesagt eröffnet unsere familienweite Halluzinationsmethode eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Gerüstmöglichkeiten für die Substratbindung und die Platzierung katalytischer Reste, was besonders wichtig ist, wenn der Reaktionsmechanismus und seine Förderung nicht vollständig verstanden sind: viele alternative strukturelle und katalytische Hypothesen können leicht mit Form und chemisch komplementären Bindungstaschen, aber unterschiedlichen Platzierungen der katalytischen Reste gezählt werden. Obwohl Luciferasen einzigartig darin sind, die Emission von Licht zu katalysieren, ist die chemische Umwandlung von Substraten in Produkte allen Enzymen gemeinsam, und der hier entwickelte Ansatz sollte problemlos auf eine Vielzahl chemischer Reaktionen anwendbar sein.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten für Abb. 2–4 sind online verfügbar. Die Gensequenz für LuxSit-i wurde bei der GenBank unter der Zugangsnummer OP820699 hinterlegt. Siehe Ergänzende Daten für Designmodelle von LuxSit und LuxSit-i. Codon-optimierte Plasmide, die LuxSit-i für die bakterielle und Säugetierexpression kodieren, sind über Addgene erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die makromolekulare Modellierungssuite von Rosetta (https://www.rosettacommons.org) ist für akademische und nichtkommerzielle Benutzer frei verfügbar. Kommerzielle Lizenzen für die Suite sind über das Technology Transfer Office der University of Washington erhältlich. Der Quellcode für die RIF-Docking-Implementierung ist unter https://github.com/rifdock/rifdock frei verfügbar. Alle relevanten Skripte und ein begleitendes Jupiter-Notizbuch für die familienweite Halluzinations-Scaffold-Generierung sind hier verfügbar: https://files.ipd.uw.edu/pub/luxSit/scaffold_generation.tar.gz. Alle generierten Gerüste sind hier verfügbar: https://files.ipd.uw.edu/pub/luxSit/scaffolds.tar.gz. Computerdesign-Skripte für die Luciferase-Bibliotheken sind hier verfügbar: https://files.ipd.uw.edu/pub/luxSit/luciferase_designs_methods.zip.

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Referenzen herunterladen

Wir danken B. Wicky und R. Kibler für ihre Unterstützung bei CD-Messungen; X. Li für Hilfe bei der massenspektrometrischen Analyse von Proteinen; D. Feldman für die erste Untersuchung der Zellbildgebung; L. Milles für die Optimierung des Golden-Gate-Montageprotokolls; und die National Natural Science Foundation of China (22103060) für die Bereitstellung von Rechenressourcen, die in Quantenmechanik und MD-Simulationen verwendet wurden. Einige Abbildungstafeln wurden teilweise mit BioRender.com erstellt (Abb. 4e und Extended Data Abb. 2 und 10c). Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsergebnisse wurden teilweise vom National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering der National Institutes of Health unter der Fördernummer K99EB031913 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder. Wir danken dem Howard Hughes Medical Institute (YK, BC und DB) für die Finanzierung; die Henrietta und Aubrey Davis Stiftungsprofessur am Department of Biochemistry (DB) der University of Washington; der NIH Pathway to Independence Award (AH-WY, K99EB031913); das United World Antiviral Research Network (UWARN) (eines der Zentren für die Erforschung neu auftretender Infektionskrankheiten; CREIDs) NIAID 1 U01 AI151698-01 (DB und AH-WY); das Audacious Project am Institut für Proteindesign (DB und AH-WY); der Open Philanthropy Project Improving Protein Design Fund (DB); die Novo Nordisk Foundation (CN, NNF18OC0030446), ein Stipendium der Washington Research Foundation (SP); E. und W. Schmidt, auf Empfehlung des Schmidt Futures-Programms (DT, GRL, JZZ, LC, SH, MD, LC und DB); und der National Science Foundation (KNH, DE und PM, CHE-1764328 und OCI-1053575 an XSEDE).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Andy Hsien-Wei Yeh, Christoffer Norn

Abteilung für Biochemie, University of Washington, Seattle, WA, USA

Andy Hsien-Wei Yeh, Christoffer Norn, Yakov Kipnis, Doug Tischer, Samuel J. Pellock, Gyu Rie Lee, Jason Z. Zhang, Ivan Anishchenko, Brian Coventry, Longxing Cao, Justas Dauparas & David Baker

Institut für Proteindesign, University of Washington, Seattle, WA, USA

Andy Hsien-Wei Yeh, Christoffer Norn, Yakov Kipnis, Doug Tischer, Samuel J. Pellock, Gyu Rie Lee, Jason Z. Zhang, Ivan Anishchenko, Brian Coventry, Longxing Cao, Justas Dauparas, Samer Halabiya, Michelle DeWitt, Lauren Carter & David Baker

Abteilung für Biomolekulartechnik, University of California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA

Andy Hsien-Wei Yeh

Howard Hughes Medical Institute, University of Washington, Seattle, WA, USA

Yakov Kipnis, Brian Coventry und David Baker

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

Declan Evans, Pengchen Ma und KN Houk

School of Chemistry, Xi'an Key Laboratory of Sustainable Energy Materials Chemistry, MOE Key Laboratory for Nonequilibrium Synthesis and Modulation of Condensed Matter, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, China

Pengchen Ma

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DB hat diese Arbeiten überwacht. AH-WY konzipierte das Projekt und führte die experimentelle Charakterisierung durch. AH-WY, YK und CN konzipierten und untersuchten die anfänglichen Designstrategien und AH-WY führte das rechnerische Design von Luciferasen durch. CN konzipierte und implementierte die familienweite Halluzinationspipeline. CN, DT, SJP und IA führten den Gerüstentwurf durch. SJP führte das ProteinMPNN-Sequenzdesign von NTF2-Gerüsten durch. KNH betreute DE und PM bei MD- und Quantenmechanikberechnungen und trug zum Verfassen der mechanistischen Teile des Manuskripts bei. GRL hat die rechnerische SSM-Simulation entwickelt. JZZ präparierte Säugetierzellen und führte eine mikroskopische Bildgebung durch. BC und LC haben die Tuning-File-Funktion in RifDock integriert. JD hat ProteinMPNN entwickelt. SH half beim Aufbau der entworfenen Bibliothek. MD und LC unterstützten die Proteinexpression und -reinigung. AH-WY, CN und DB haben das erste Manuskript geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und trugen zum endgültigen Manuskript bei.

Korrespondenz mit Andy Hsien-Wei Yeh oder David Baker.

AH-WY, CN, YK, DT, SJP, IA und DB sind Miterfinder mehrerer vorläufiger Patentanmeldungen (Anmeldenummern 63/300171, 63/300178, 63/381922 und 63/381924, eingereicht von der University of Washington). die in diesem Artikel beschriebenen De-novo-Luciferasen und Proteingerüste. AH-WY, CN, JZ und DB sind Aktionäre von Monod Bio, einem Unternehmen, das sich die Entwicklung der in diesem Manuskript beschriebenen Erfindungen zum Ziel gesetzt hat. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Berechnungen der Dichtefunktionaltheorie (DFT) legen nahe, dass die Bildung eines anionischen Zustands die wesentliche Elektronenquelle für die Aktivierung von Triplettsauerstoff (3O2) ist. Gestützt durch theoretische25,26 und experimentelle Beweise27,28 erfolgt der nächste Oxygenierungsprozess wahrscheinlich über einen Einzelelektronentransfermechanismus (SET), bei dem das umgebende Reaktionsfeld die Änderung der freien Gibbs-Energie (ΔGSET) stark beeinflussen könnte. Schließlich kann die Thermolyse eines Dioxetan-Lichtemitter-Zwischenprodukts Photonen über den Mechanismus der allmählich reversiblen ladungstransferinduzierten Lumineszenz (GRCTIL) erzeugen, der im Allgemeinen exergonisch ist. Da alle historischen Beweise auf Berechnungen in virtuellen Lösungsmitteln oder Chemilumineszenz in idealen organischen Lösungsmitteln basieren, blieb der detaillierte Mechanismus einer Luciferase-katalysierten Lumineszenzreaktion unklar. Wir schlugen vor, dass der Schlüsselschritt des Enzyms darin besteht, die Bildung eines anionischen Zustands zu fördern und eine geeignete Umgebung zu schaffen, um einen effizienten SET zu ermöglichen. Ziel dieser Studie ist es daher, ein Enzymreaktionsfeld zu entwerfen, das das Substrat umgibt, um den anionischen Substratzustand zu stabilisieren und die lokale Protonenaktivität, Lösungsmittelpolarität und Hydrophobie für die effiziente Aktivierung von 3O2 zu verändern.

Rechnerisch entworfene DNA-Sequenzen wurden in einem Oligo-Array gekauft, wo die Fragmente durch PCR amplifiziert, zusammengesetzt und in einen bakteriellen pBAD-Expressionsvektor ligiert wurden. Die Plasmidbibliothek wurde zur Transformation von DH10B-Zellen verwendet. Jede auf der LB-Agarplatte gewachsene Kolonie repräsentierte ein Luciferase-Design. Die Platten wurden mit DTZ-Lösung besprüht und mit einem ChemiDoc-Imager abgebildet, um aktive Kolonien zu identifizieren. Ausgewählte Kolonien wurden in 96-Well-Platten inokuliert, exprimiert und gereinigt, um die individuelle Luciferase-Aktivität zu bestätigen. Plasmide können dann einzeln sequenziert werden, um aktive Designmodelle aufzuzeigen, die Einblicke in das Designprinzip und die Enzymfunktionen liefern, oder sie können zur weiteren Evolution einer Zufallsmutagenese unterzogen werden. Einfügung: Bei diesem Screening wurden drei Luciferasen identifiziert. Wir bezeichnen die aktivste und DTZ-spezifischste Luciferase als „LuxSit“.

a–c, Die rekombinante Expression von a, LuxSit, b, LuxSit-i und c, LuxSit-f in E. coli. Die Anmerkungen für jede Spur sind die folgenden – 1: Pre-IPTG; 2: Post-IPTG; 3: Lösliches Lysat; 4: Durchfluss; 5: Waschen; 6: Elusion; 7: Post-TEV-Spaltung; 8: Nach der SEC. d–f, Größenausschlusschromatographie des gereinigten d, LuxSit; e, LuxSit-i; und f, LuxSit-f-Monomer. g–i, entfaltetes Massenspektrum von g, LuxSit, h, LuxSit-i und i, LuxSit-f. j,k, Spektren des fernultravioletten Zirkulardichroismus (CD) (linkes Feld) von j, LuxSit-i; und k, LuxSit-f bei 25 °C (schwarze Linie), 95 °C (rote Linie) und wieder auf 25 °C abgekühlt (grüne Linie). CD-Schmelzkurve bei 220 nm (rechtes Bild). l: Der Dimer-SEC-Peak wurde beobachtet, als LuxSit-i auf eine hohe Konzentration (~50 μM) in Tris-Puffer mit pH 8,0 konzentriert wurde. Sowohl die dimeren als auch die monomeren SEC-Fraktionen zeigten auf der SDS-PAGE die erwartete Größe und beide Peaks waren katalytisch aktiv und emittierten in Gegenwart von 25 μM DTZ Lumineszenz.

a, Coomassie-gefärbte SDS-PAGE von HTZ3-D2 und HTZ3-G4, gereinigt aus rekombinanter Expression in E. coli. b: Vergrößerte Ansichten von HTZ3-D2 (linkes Feld) und HTZ3-G4 (rechtes Feld) veranschaulichten die Seitenketten-Präorganisation von Luciferase-h-CTZ-Wechselwirkungen. c,d, Größenausschlusschromatographie (links), entfaltetes Massenspektrum (Mitte) und die normalisierten Luciferase-Aktivitäten an ausgewählten Verbindungen (rechts) von c, HTZ3-D2 und d, HTZ3-G4, was auf eine hohe Spezifität für das Design hindeutet Zielsubstrat, h-CTZ. e, Abhängigkeit der Substratkonzentration von LuxSit (mit DTZ), HTZ3-D2 (mit/h-CTZ) und HTZ3-G4 (mit/h-CTZ) in PBS. Alle Datenpunkte wurden an die Michaelis-Menten-Gleichung angepasst. HTZ3-D2 und HTZ3-G4 zeigten Km-Werte von 7,9 und 19,5 μM mit ~25 % bzw. ~58 % Imax von LuxSit. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt.

Der berechnete ddGbind jeder Mutation wurde als Funktion der relativen durchschnittlichen experimentellen Luciferase-Aktivität aufgetragen. Die ddG-Bindung hypothetischer katalytischer Reste: a, Tyr14–His98 und b, Asp18–Arg65-Dyaden, war im Allgemeinen nicht die niedrigste, was darauf hindeutet, dass diese entworfenen katalytischen Reste für die Substratbindung nicht günstig sind. Rote Punkte stellen die Wildtyp-Aminosäuren (LuxSit) dar. Der Rang von Wildtyp-ddGbind für jede auf Aktivität überprüfte Position wird mit einer Heatmap in c angezeigt. d–f, Das Wildtyp-ddGbind der Reste, die für d,e, π–π-Stapelung oder f, hydrophobe Wechselwirkungen konzipiert sind, war im Vergleich zu den ddGbind-Werten der Mutation am niedrigsten. Dies zeigt, dass die Sequenz für die Substratbindung nahezu optimal ist und das Designmodell zuverlässig ist.

Wir haben eine vollständig randomisierte Bibliothek an 60, 96 und 110 Positionen erstellt, um alle möglichen Kombinationen umfassend zu prüfen. Nach dem koloniebasierten Screening identifizierten wir mit DTZ viele Kolonien mit starken Luciferase-Aktivitäten. Jede Kolonie wurde einzeln in jeder Vertiefung von Platten mit 96 Vertiefungen (1 ml Kultur) exprimiert und entsprechend gereinigt (siehe ergänzende Methoden). a: Die individuelle Lumineszenzaktivität jedes ausgewählten Mutanten wurde aufgezeichnet und mit dem Elternteil LuxSit verglichen. Lumineszenzaktivitäten wurden in Gegenwart von 25 μM DTZ gemessen. Die Lumineszenzaktivität (RLU) wurde als integriertes Signal über die ersten 15 Minuten angezeigt. Statistische Analyse der Aminosäurehäufigkeit im Vergleich zur Luciferase-Aktivität an den Resten b, 60, c, 96 und d, 110. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (n variiert in jedem Balken, da die Mutanten aus einer randomisierten Bibliothek ausgewählt wurden). Es wurde bestätigt, dass Arg60 unter allen ausgewählten Mutanten veränderbar ist, da Arg60 möglicherweise strukturell weniger genau definiert ist, da es aus einer Schleife hervorgeht und keinen Wasserstoffbrückenbindungspartner hat. Ala96 bevorzugt größere Seitenkettensubstitutionen (Leu, Ile, Met und Cys) und Met110 bevorzugt hydrophobe Reste (Val, Ile und Ala). Einer neu entdeckten Variante (R60S/A96L/M110V) mit einem mehr als 100-fach höheren Photonenfluss als LuxSit wurde aufgrund ihrer hohen Helligkeit LuxSit-i zugewiesen. Im Sequenz-Alignment werden Mutationen in gelber Schrift und grauem Hintergrund hervorgehoben. Die konservierten katalytischen Dyaden Asp18–Arg65 und Tyr14–His98 sind in grüner und blauer Schriftart dargestellt.

a, Normalisierte Emissionskinetik von 15.000 intakten HeLa-Zellen, die LuxSit-i (rot), 100 nM gereinigtes LuxSit-i (grün) oder 100 nM gereinigtes LuxSit-f (blau) in Gegenwart von 50 μM DTZ exprimieren. Die längere Emissionskinetik in HeLa-Zellen ist wahrscheinlich auf die Diffusionsrate von DTZ durch Zellmembranen zurückzuführen. b: Normalisierte Lumineszenzabklingkurven von LuxSit-i in verschiedenen pH-Puffer zeigten einen pH-abhängigen katalytischen Mechanismus. c: Die Lumineszenzquantenausbeute wurde aus dem integrierten Lumineszenzsignal bis zur vollständigen Umwandlung von 125 pmol Substraten in Photonen in Gegenwart von 50 nM entsprechender Luciferase geschätzt (siehe ergänzende Methoden). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt (n = 3).

a, Das durch die Dichtefunktionaltheorie (DFT) berechnete Profil der freien Energie zeigt, dass Triplettsauerstoff über den Reaktantenkomplex Int2 und TS1 direkt mit der anionischen Spezies von DTZ (Int1) reagieren kann. Das Dioxetan-Zwischenprodukt Int3 spaltet sich dann in einem Singulett-Übergangszustand mit offener Schale OSSTS2 und bildet das angeregte Zwischenprodukt Int4*, das schnell CO2 ausstößt und das Emissionsprodukt Int5 bildet. Hinweis: Entweder Int4* oder Int5* emittieren im beobachteten Bereich, aber die Lebensdauer von Int4* ist sehr kurz und wandelt sich wahrscheinlich vor der Emission vollständig in Int5* um. b, Int2 und Int3 wurden sowohl an LuxSit als auch an LuxSit-i angedockt und die Bindungen wurden durch Molekulardynamik (MD) bewertet. Die Abstände zwischen His98 zu O1 (obere Reihe) und Arg65 zu N1 (untere Reihe) des Substrats wurden über 500 ns MD-Simulationen aufgezeichnet. LuxSit-i (blaue Spur) bindet Int2′ (Mitte) deutlich besser als LuxSit (rote Spur), was darauf hindeutet, dass die Mutationen von LuxSit-i eine Bindungstasche bieten, die besser zu TS1 passt. Diese Bindungsorientierung bringt N1 des Substrats viel näher an Arg65 und sorgt so für eine bessere Ladungsstabilisierung für den Hochenergie-Übergangszustand. c, Andocken der Peroxidanionenform von Bis-CTZ in die Tasche von LuxSit-i; Die blaue Überlagerung stellt DTZ im ursprünglichen Designmodell dar. Während der MD-Simulation stört der hinzugefügte benzylische Kohlenstoff von Bis-CTZ (grüne Spur) die Formkomplementarität zwischen LuxSit-i und den Übergangszuständen (TS1 und TS2), wodurch die Ladungsstabilisierung durch Arg65 verringert wird. Diese Ladungsstabilisierung ist für den Ablauf der Reaktion notwendig, was die hohe Substratspezifität von LuxSit-i für DTZ gegenüber Bis-CTZ erklärt.

a,b, Fluoreszenzbildgebung von lebenden a-, HEK293T- und b-HeLa-Zellen, die LuxSit-i-mTagBFP2 exprimieren, das nicht gezielt oder im Zellkern (Histone2B), der Plasmamembran (KRasCAAX) oder den Mitochondrien (DAKAP) lokalisiert ist. Maßstabsbalken: 10 μm. c,d, Lumineszenzsignale wurden mit 15.000 intakten c, HEK293T- oder d, HeLa-Zellen in Gegenwart von 25 μM DTZ in DPBS gemessen. Die Transfektionseffizienzen liegen bei 60–70 % für HEK293T-Zellen und 5–10 % für HeLa-Zellen. e, Lumineszenzemissionsspektren, die von LuxSit-i-exprimierenden HEK293T-Zellen erfasst wurden, stimmen mit den Emissionsspektren von rekombinantem LuxSit-i, gereinigt aus E. coli, überein. f,g, Lumineszenzsignale wurden mit 15.000 f, intakten LuxSit-i-exprimierenden HEK293T-Zellen oder g, Zelllysat in Gegenwart von 25 μM angegebenem Substrat in DPBS gemessen. Die Lumineszenzintensitäten wurden auf das DTZ-Signal normalisiert und zeigten in zellbasierten Tests eine hohe DTZ-Spezifität gegenüber anderen Substraten. Die Daten wurden als Gesamtlumineszenzsignal über die ersten 20 Minuten ± Standardabweichung (n = 3) angezeigt. h, Normalisiertes Lumineszenzintensitätsprofil von Linien, die über verschiedene Zellen (n = 10) des Hauptlumineszenzbilds in Abb. 3c verlaufen; graue Linien stellen nicht transfizierte Zellen dar. Fehlerbalken stellen ± SEM dar.

a, Die Orthogonalitätsbeziehung zwischen den Lumineszenzpaaren LuxSit-i-DTZ und RLuc-PP-CTZ (Prolume Purple, Methoxy-e-Coelenterazin). Die angegebenen Prozentsätze jeder Luciferase wurden in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt, sodass insgesamt 100 % erreicht wurden. Nach der Zugabe von 25 µM DTZ- und PP-CTZ-Substraten wurde gleichzeitig gefiltertes Licht von 528/20- und 390/35-Kanälen gemessen. b: Wärmekarte zeigt das Lumineszenzsignal für einzelne Luciferase (100 nM) oder 1:1-Mischung in Gegenwart der verwandten oder nicht verwandten (DTZ oder PP-CTZ oder beide) Substrate. Die Antwortsignale wurden gleichzeitig von einem Neo2-Plattenlesegerät mit 528/20- und 390/35-nm-Filtern erfasst. c, Multiplex-Luciferase-Assay in lebendem HEK293T nach Co-Transfektion von CRE-RLuc-, NFκB-LuxSit-i- und CMV-CyOFP-Plasmiden und Stimulation durch Forskolin (FSK) oder menschliches TNF. d, e, 15.000 intakte Zellen wurden entweder im d-, substrataufgelösten oder im e-, spektral aufgelösten Modus nach Zugabe von DTZ, PP-CTZ oder sowohl DTZ als auch PP-CTZ in DPBS ohne Zelllyse untersucht (siehe ergänzende Methoden). Das Flächenscannen des CyOFP-Fluoreszenzsignals wurde verwendet, um die Zellzahl und die Transfektionseffizienz abzuschätzen. Die gemeldete Einheit war RLU/au; relative Lichteinheiten/Fluoreszenzintensitätsmessungen bei Ex./Em. = 480/580 nm. Alle Daten wurden auf die entsprechende nicht stimulierte Kontrolle normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yeh, A.HW., Norn, C., Kipnis, Y. et al. De-novo-Design von Luciferasen mithilfe von Deep Learning. Natur 614, 774–780 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05696-3

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Eingegangen: 19. Januar 2022

Angenommen: 03. Januar 2023

Veröffentlicht: 22. Februar 2023

Ausgabedatum: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05696-3

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