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Jan 06, 2024

Über das Zusammenspiel zwischen Lipiden und der asymmetrischen Dynamik eines NBS-degenerierten ABC-Transporters

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 149 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Multiresistenz-assoziierte Proteine ​​sind Exporteure der ABC-C-Familie. Sie sind in der Pharmakologie von entscheidender Bedeutung, da sie verschiedene Substrate durch Membranen transportieren. Die Rolle der degenerierten Nukleotidbindungsstelle (NBS) bleibt jedoch unklar, ebenso wie das Zusammenspiel mit der umgebenden Lipidumgebung. Hier schlagen wir einen dynamischen und strukturellen Überblick über MRP1 von ca. vor. 110 μs Molekulardynamiksimulationen. Die ATP-Bindung an NBS1 wird wahrscheinlich über mehrere Transportzyklen hinweg aufrechterhalten. Das asymmetrische NBD-Verhalten wird durch eine geringere Signalübertragung von NBD1 zum Rest des Proteins gewährleistet, da zwischen NBD1 und den Kopplungshelices keine Kugel- und Sockelkonformation vorliegt. Obwohl umgebende Lipide eine aktive Rolle bei der allosterischen Kommunikation zwischen der Substratbindungstasche und NBDs spielen, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Lipidzusammensetzung nur einen begrenzten Einfluss hat, hauptsächlich durch Beeinflussung der Transportkinetik. Wir glauben, dass unsere Arbeit auf andere degenerierte NBS-ABC-Proteine ​​ausgeweitet werden kann und Hinweise zur Entschlüsselung mechanistischer Unterschiede zwischen ABC-Transportern liefert.

ATP-bindende Kassettentransporter (ABC) gehören zu einer der größten Trans-Königreich-Protein-Superfamilien. Die strukturelle Auflösung mehrerer ABC-Transporter hat zu unterschiedlichen Konformationen geführt (nämlich nach innen gerichtet – IF, nach außen gerichtet – OF und okkludiert), was den alternierenden Zugang als das wahrscheinlichste Modell zur Rationalisierung der Substrattranslokation entlang des Transportzyklus verdeutlicht1, 2,3. ABC-Transporterstrukturen bestehen aus mindestens zwei Transmembrandomänen (TMDs), die aus sechs Transmembranhelices (TMHs) bestehen. TMDs sind an zwei Nukleotidbindungsdomänen (NBDs) gebunden, die evolutionär über die Arten hinweg konserviert sind. Der ABC-Transportzyklus erfordert die Bindung zweier ATP-Moleküle und die bei der Hydrolyse von mindestens einem davon freigesetzte Energie3,4,5,6,7. ATP-Moleküle binden an der Grenzfläche des NBD-Dimers, das eine nichtkovalente pseudosymmetrische Kopf-Schwanz-Anordnung annimmt; Ermöglicht die Bildung von zwei Nukleotidbindungsstellen (NBSs). Beide NBSs werden durch die konservierten Walker A- und B-Motive, die A-, Q- und H-Schleifen eines NBD und die ABC-Signatursequenz und die X-Schleife des anderen NBD4,5,7,8 gebildet.

Mit Ausnahme einiger weniger Mitglieder (z. B. CFTR, ABCA4, ABCD4, SUR1/2)2,3,9,10 sind eukaryotische ABC-Transporter Exporteure, dh sie extrudieren Substrate in das extrazelluläre Kompartiment. Eukaryotische ABC-Transporter wurden früher in Familien vom Typ I (ABCB, ABCC, ABCD) und Typ II (ABCA, ABCG) eingeteilt. Kürzlich haben die strukturellen und funktionalen Unterschiede von ABC-Transportern zu einer neuen faltungsbasierten Klassifizierung2,3 geführt, bei der die bisherigen Exporteure vom Typ I und Typ II die Faltung vom Typ IV bzw. V übernehmen.

Multidrug-Resistenz-assoziierte Proteine ​​(MRPs) sind NBS-degenerierte ABC-Transporter3,4,5,7,8. Im nichtkanonischen NBS1 sind das katalytische Walker B-Glutamat, das A-Loop-Tyrosin und der erste Glycinrest des ABC-Signaturmotivs zu Aspartat-, Tryptophan- bzw. Valinresten mutiert. Diese Mutationen waren mit einer deutlich geringeren ATPase-Aktivität und einer höheren ATP-Bindungsaffinität für das degenerierte NBS14,7 verbunden. Diese Beobachtungen haben kürzlich zur Entwicklung eines neuen asymmetrischen Modells für die NBD-Funktion geführt, das die Dynamik und Funktion des gesamten Transporters beeinflussen kann3,7. Die Funktion und Kinetik von bovinem ABCC1/MRP1 (bMRP1) wurde umfassend und gründlich untersucht, indem Strukturinformationen aus Kryo-Elektronenmikroskopie-Experimenten (Kryo-EM) und Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energietransfer (smFRET) kombiniert wurden5. Trotz der soliden Erkenntnisse, die die Auflösung der bMRP1-Struktur lieferte, wurden ungeklärte Unterschiede zwischen ABCB- und ABCC-Exporteuren beobachtet, was teilweise auf die nicht native, auf Detergenzien basierende Umgebung zurückzuführen ist, die für bMRP1-Experimente verwendet wurde7,11.

ABC-Transporter spielen eine entscheidende Rolle in der Pharmakologie, indem sie eine enorme Vielfalt an Substraten, darunter Xenobiotika und endogene Verbindungen, durch Zellmembranen transportieren. Ihre pharmakologische Rolle wurde beispielsweise vom International Transporter Consortium (ITC) hervorgehoben, das eine Liste von Transportern mit „neuer klinischer Bedeutung“ erstellt hat, deren Wechselwirkungen mit neuen Xenobiotika bei der Arzneimittelentwicklung untersucht werden müssen12. In den letzten Jahrzehnten haben ABCC-Transporter, in denen MRPs enthalten sind, aufgrund ihrer Rolle in der Pharmakologie, einschließlich der interindividuellen Reaktionen von Patienten auf Behandlungen, zunehmend an Interesse gewonnen. Beispielsweise wurden Untersuchungen zu ABCC2/MRP2 und ABCC4/MRP4 von der ITC empfohlen, um retrospektiv eine mechanistische Erklärung klinischer Beobachtungen hinsichtlich der Medikamentendisposition zu liefern13. Angesichts der Rolle von MRPs in den lokalen Pharmakokinetik- und Pharmakodynamik-Beziehungen (PK/PD) und damit in der lokalen Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln14 besteht immer noch die Notwendigkeit, den In-situ-MRP-Transportzyklus zu entschlüsseln, um einen umfassenden Überblick über Ereignisse beim Durchqueren xenobiotischer Membranen zu erhalten. Dies ist besonders relevant für MRPs, die sich in proximalen tubulären Nierenzellen und Leberhepatozyten befinden, da Nieren und Leber an der Eliminierung der meisten weltweit verwendeten Xenobiotika beteiligt sind15.

Leider gibt es noch keine experimentell gelöste Struktur für menschliche MRPs. Es wurde eine MD-verfeinerte Protein-Threading-MRP4-Struktur16 vorgeschlagen, deren rechnerische Auflösung funktionelle Untersuchungen oder eine gründliche Strukturdynamik ausschließt. Allerdings wurden mehrere Konformationen des bMRP1-Transporters durch Kryo-EM4,5,8 aufgelöst. Angesichts der hohen Sequenzähnlichkeit zum menschlichen Orthologen hMRP1 (91 %) sowie innerhalb anderer menschlicher MRPs (ca. 40–50 %) erscheint die Verwendung von bMRP1-Strukturen als Prototyp für die Untersuchung der Dynamik und Funktionen von MRP-Transportern relevant3. MRP1-Exporteur übernimmt die Faltung vom Typ IV; Es verfügt jedoch über ein zusätzliches N-terminales TMD, das aus fünf TMHs besteht. Es wurde gezeigt, dass das sogenannte TMD0 weder bei der ABC-ATPase-Aktivität noch beim Substrattransport eine Rolle spielt3,4,8. Daher kann ein MRP1-Modell ohne TMD0 als Prototyp für ABCC-Exporteure verwendet werden, selbst für diejenigen, die diese Domäne nicht besitzen (z. B. MRP4). TMD0 ist über einen Linker (L0) mit herkömmlichen ABC-TMDs verbunden, der nachweislich sowohl für den Trafficking als auch für die Funktion zwingend erforderlich ist8,17. Die L0-Sequenz bleibt in allen Mitgliedern der ABCC-Unterfamilie auch in Abwesenheit von TMD08 konserviert. Es ist wichtig zu beachten, dass im vorliegenden Manuskript die standardmäßige TMH-Kennzeichnung für ABC Typ IV verwendet wird, d. h. TMH1 bis TMH12, da das vorliegende Modell TMD0 nicht enthält.

Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, den ABC-Konformationsraum1,18 von MRP1 unter Berücksichtigung verschiedener Bindungszustände (nämlich Apo-, ATP- und/oder Leukotrien-C4-LTX-gebundene Zustände8 für die IF-Konformation und ATP-gebundener Zustand4 für die OF-Konformation) abzubilden, wobei die Bedeutung der Asymmetrie hervorgehoben wird in ABC-Domänen. Darüber hinaus wurde angesichts der Bedeutung der umgebenden Lipide im ABCC-Transportzyklus11,19 auch das Zusammenspiel zwischen der Lipiddoppelschicht und der Proteindynamik untersucht. Dies wurde durch die Verwendung verschiedener rechnerisch symmetrischer Membranmodelle aus (i) reinem POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), (ii) reinem POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn) erreicht -glycero-3-phosphoethanolamin), (iii) POPC:POPE (3:1), (iv) POPC:Chol (3:1) und (v) POPC:POPE:Chol (2:1:1); Letzteres kommt der In-situ-MRP1-Dynamik am nächsten. Um die Ziele zu erreichen, wurden alle Atome unvoreingenommene Molekulardynamiksimulationen (MD) im Mikrosekundenbereich durchgeführt.

Um den während der Simulationen in POPC:POPE:Chol (2:1:1) abgetasteten Konformationsraum zu untersuchen, der die gebundenen Zustände von bMRP1 berücksichtigt, wurden gemäß früheren Studien 1,11,18 verschiedene Strukturdeskriptoren berücksichtigt. Für TMDs wurden nämlich intrazelluläre (IC) und extrazelluläre (EC) Winkel überwacht, während für NBDs der NBD-Abstand und der NBD-Schaukel-Drehwinkel verwendet wurden (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1–6); Letzteres passt sich bekanntermaßen entlang des OF-zu-IF-Übergangs in ABCB1/P-gp18 an. Diese Strukturdeskriptoren wurden auch an einem großen Datensatz experimentell aufgelöster ABC-Proteine, einschließlich bMRP1-Kryo-EM-Strukturen, gemessen, um den ABC-Konformationsraum zu rekonstruieren (Abb. 1d und Ergänzungstabelle 1). Die bekannten ABC-Konformationen wurden effizient dargestellt, d. h. IF open und okkludiert, OF, sowie die kürzlich gelösten asymmetrischen unlock-returned (UR)-Turnover1-Konformationen. bMRP1-MD-Simulationen zeigten das spontane Schließen des intrazellulären Hohlraums für alle IF-Systeme, unabhängig vom gebundenen Zustand und der Membranzusammensetzung (Abb. 1a, b, ergänzende Abbildungen 1–6 und ergänzende Tabellen 2–5). Die durchschnittlichen NBD-Abstände und IC-Winkel waren deutlich kleiner als die für bMRP1-Kryo-EM-Strukturen berechneten Werte. Beispielsweise konvergierten die IF-Konformationen in Richtung ähnlicher IC-Winkel- und NBD-Abstandswerte im Bereich von 26,0 ± 0,5 bis 35,4 ± 1,8° bzw. von 30,3 ± 1,9 bis 55,0 ± 2,8 Å (Abb. 1b, ergänzende Abb. 1, 3–4, und Ergänzungstabellen 3–4). Interessanterweise wurde die spontane Dimerisierung von NBDs auch in Abwesenheit von ATP-Molekülen beobachtet. Der Unterschied zwischen Simulationen und Kryo-EM-Struktur könnte teilweise durch die Verwendung von nicht nativen Detergenzien in Experimenten erklärt werden7,11. Tatsächlich zeigten aufgelöste Kryo-EM-Strukturen von bMRP1 größere IC-Winkel und NBD-Abstände als andere in nativen Umgebungen aufgelöste ABC-Strukturen (Abb. 1d). Auf der extrazellulären Seite der Lipiddoppelschichtmembran zeigten MD-Simulationen von OF bMRP1-(ATP)2 im Vergleich zu bMRP1 OF-Kryo-EM-Strukturen kleinere Öffnungen des EC-Tors, was auf die Existenz eines etwas offeneren Zustands schließen lässt. Die berechneten EC-Winkel blieben jedoch klein (weniger als 20 ° in POPC: POPE: Chol (2: 1: 1), siehe Abb. 1a und ergänzende Abbildungen 1–2 und ergänzende Tabelle 2), was den Wiedereintritt des Substrats ausschließt .

Nach innen gerichtete Konformationen: Apo-Zustand (IF apo bMRP1), substratgebunden (bMRP1-LTX), ATP-gebunden (bMRP1-(ATP)2), ATP/Substrat-gebunden (bMRP1-LTX-(ATP)2) ; Nach außen gerichtete Konformation: ATP-gebunden (OF bMRP1-(ATP)2). a Repräsentative Schnappschüsse der verschiedenen hier untersuchten bMRP1-Systeme zu Beginn und am Ende von MD-Simulationen. b Zeitliche Entwicklung der IC- und EC-Winkel für IF- und OF-Strukturen. IC- und EC-Winkel wurden gemäß den vorgeschlagenen ABC-Strukturparametern berechnet, die im Abschnitt „Methoden“ definiert sind1,11,18. c Zeitliche Entwicklung wichtiger NBS-Abstände, definiert durch Inter-NBD-Abstände zwischen Walker-A-Glycin- und ABC-Signatur-Serinresten8. d Projektion von bMRP1-Strukturparametern auf den ABC-Konformationsraum, der aus mehreren aufgelösten ABC-Strukturen erhalten wurde. Die Ergebnisse wurden aus n = 3 MD-Trajektorien für jedes System erhalten und für die Standardabweichungen angegeben sind. PDB-IDs der aufgelösten bMRP1-Kryo-EM-Strukturen werden ausdrücklich erwähnt. Die ersten und zweiten TMDs sind jeweils in Orange und Blau dargestellt, und NBD1 und NBD2 sind jeweils in Gelb und Cyan dargestellt.

Obwohl Trajektorien, die mit dem Zustand vor der Translokation (dh bMRP1-LTX-(ATP)2) durchgeführt wurden, dazu neigen, den ABC-Konformationsunterraum der OF-Konformation zu bevölkern (Abb. 1d), wurde keine Substrattranslokation beobachtet. Die für den bMRP1-LTX-(ATP)2-Zustand berechneten NBD-Twist-Werte ähneln den OF-ABC-Konformationen. Allerdings bleiben die NBD-Abstände größer als bei aufgelösten substratfreien OF-ABC-Strukturen und OF-bMRP1-(ATP)2-Simulationen. Abstände zwischen Cα-Atomen des ABC-Signaturmotivs Serin und eines Walker-A-Glycins wurden überwacht (d. h. Gly681-Ser1430 und Ser769-Gly1329, jeweils bezeichnet als \({d}_{{GS}}^{{NBS}1}\ ) und \({d}_{{GS}}^{{NBS}2}\), Abb. 1c, Ergänzende Abbildungen 7–8). Strukturelle Unterschiede zwischen den Zuständen vor und nach der Translokation (d. h. bMRP1-LTX-(ATP)2 bzw. OF bMRP1-(ATP)2) legen nahe, dass vor dem Substrattranslokationsereignis ein Konformationsübergang des NBD-Dimers erforderlich ist . Ein solcher Übergang von der sogenannten „nichtkompetenten“ zur „kompetenten“ NBD-Dimerkonformation löst wahrscheinlich TMD-Konformationsübergänge aus, was darauf hindeutet, dass dies der limitierende Schritt für den IF-zu-OF-Übergang sein könnte.

bMRP1-Konformationen können auch anhand der TM-Porenöffnung dokumentiert werden (Ergänzende Abbildungen 9–13). Wie erwartet ist die TM-Pore für OF bMRP1-(ATP)2 im oberen Blättchen größer (bei z = 18 und 5 Å über dem Zentrum der Lipiddoppelschicht, ergänzende Abbildungen 10–11), während die IF-Konformationen geschlossen bleiben. Interessanterweise wurde bei 5 Å eine Flaschenhalsform für die IF-Konformation beobachtet. Trotz der dynamischen Variabilität, die für TM-Radiusprofile im unteren Blättchen beobachtet wurde, wurde die folgende Sequenz hinsichtlich der Öffnung beobachtet (ergänzende Abbildungen 12–13): IF apo bMRP1 > IF bMRP1-(ATP)2 > IF bMRP1-( LTX) ≈ WENN bMRP1-LTX-(ATP)2 > OF bMRP1-(ATP)2. Dies steht im Einklang mit der Rolle des Substrats, von dem gezeigt wurde, dass es TM-Bündel in ABC-Transportern18, einschließlich bMRP14,5, bindet. Im Gegensatz zum IC-Winkel und zum NBD-Abstand, die in der frühen Phase von MD-Simulationen tendenziell schnell abnehmen, bleiben die TM-Porenradien in ausgewählten Tiefen der Lipiddoppelschicht entlang der Simulationen relativ konstant.

Die Gesamtflexibilität wurde durch Berechnung der quadratischen Mittelwertschwankungen bewertet (RMSF, ergänzende Abbildung 14). RMSF pro Rest bestätigt das asymmetrische Verhalten von NBDs7, wobei NBD2 flexibler ist als NBD1. Für jedes System wurden Backbone-basierte Hauptkomponentenanalysen (PCA) durchgeführt. Es wurden nur die drei ersten größten Hauptkomponenten berücksichtigt, die je nach System 85,6 % bis 95,9 % der gesamten Strukturvariabilität aufzeigten (ergänzende Abbildung 15). Bei allen IF-Simulationen wurden die drei ersten größten Variabilitäten systematisch asymmetrischen NBD-Bewegungen zugeordnet, zu denen NBD2 mit 27,0 bis 59,6 % der Bewegung am meisten beitrug (ergänzende Abbildung 16). Die ersten Hauptkomponenten wurden größtenteils NBD-Dreh- und Schaukelbewegungen zugeordnet (Ergänzungsfilme 1–5). Dies steht im Einklang mit der experimentell vorgeschlagenen höheren Flexibilität von NBDs aus smFRET-Experimenten entlang des kinetischen Zyklus von MRP15. In Bezug auf OF-Simulationen waren die beiden ersten Hauptkomponenten mit einer konzertierten NBD-Drehbewegung und Öffnung der extrazellulären Seite verbunden, die hauptsächlich durch TMH4, TMH5, TMH7 und TMH8 vermittelt wurde. Es wurde vermutet, dass diese TMHs sich in ABCB1/P-gp18 wie ein einzelnes Bündel verhalten. Darüber hinaus war NBD2 in geringerem Maße als bei IF-Konformationen stärker an dieser gemeinsamen Bewegung beteiligt als NBD1.

Das asymmetrische Verhalten wurde auch durch die supramolekulare Anordnung zwischen NBD1 und NBD2 veranschaulicht, für die zwei Hauptsubpopulationen für Apo-, bMRP1-(ATP)2- und bMRP1-LTX-Zustände beobachtet wurden (Abb. 2a). Interessanterweise blieben die Wechselwirkungen zwischen NBSs und NBDs entlang unserer MD-Simulationen auch in Abwesenheit von ATP-Molekülen erhalten. Es wurden zwei NBD-Konformationen beobachtet, entweder asymmetrisch offene oder geschlossene NBD-Dimeranordnungen, zugunsten der letzteren. Überraschenderweise wurden beide Anordnungen auch in bMRP1-(ATP)2 beobachtet, allerdings in geringerem Ausmaß, obwohl erwartet wurde, dass ATP-Moleküle Wechselwirkungen an der NBD-Dimer-Grenzfläche aufrechterhalten. In Gegenwart sowohl von Substrat- als auch ATP-Molekülen wurde nur die geschlossene Population beobachtet, was die Informationsübertragung von der TMD-Substratbindungstasche zu NBDs darstellt, um wahrscheinlich die Energiebarriere für den IF-zu-OF-Übergang in ABC-Transportern vom Typ IV-Faltung zu senken20, 21.

a Repräsentative Schnappschüsse, die die offenen und geschlossenen Konformationen von NBD-Dimeren zeigen, die während MD-Simulationen beobachtet wurden. IF apo bMRP1, bMRP1-(ATP)2 und bMRP1-LTX zeigten zwei Hauptsubpopulationen, für die schwarze Pfeile die Bewegung hervorheben; während die Konformationen vor und nach der Translokation (nämlich bMRP1-LTX-(ATP)2 und OF bMRP1-(ATP)2) nur die geschlossene NBD-Dimerkonformation aufwiesen. NBD1, NBD2 und Kopplungshelices sind jeweils in Gelb, Cyan und Rosa dargestellt. b Systemabhängige lokale Konformationslandschaften, die aus dem in der InfleCS-Methode entwickelten GMM-basierten Ansatz erhalten wurden23,64 und den Einfluss von Nukleotiden und dem Substrat auf die Strukturdynamik von bMRP1 hervorheben. c Gemittelte Coulomb- und Van-der-Waals-Potenziale, berechnet zwischen Nukleotiden und NBS1 und NBS2, separat (800 Punkte wurden für jedes Replikat verwendet und unabhängig behandelt; Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen). d Berechnete H-Brückennetzwerke zwischen ATP und NBS1 oder NBS2 sowie zwischen LTX und Substratbindungstaschenresten (H-Brückenanteile wurden für jedes Replikat unabhängig berechnet und dann gemittelt n = 3; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung darüber).

Um das asymmetrische Verhalten von NBDs zu erklären, wurde besonderes Augenmerk auf Kopplungshelices (CH) gelegt, die die Signalübertragung von TMDs zu NBDs gewährleisten20,21. ABC-Transporter weisen nativ vier Kopplungshelices auf, die intrazelluläre Domänen von TMH2/TMH3, TMH4/TMH5, TMH8/TMH9 und TMH10/TMH11 verbinden. Die sogenannten CH2-3 und CH10-11 stehen in Kontakt mit NBD1, während CH4-5 und CH8-9 mit NBD2 interagieren (Abb. 2a). Kontakte zwischen CHs und NBDs werden durch die Bindung von ATP-Molekülen oder Substraten nicht verändert (ergänzende Abbildung 17). Interessanterweise kann man für einen gegebenen NBD einen sogenannten „schwachen CH“ (nämlich CH2-3 und CH8-9 für NBD1 bzw. NBD2) in Betracht ziehen, für den nur wenige Kontakte beobachtet wurden. Andererseits zeigte der sogenannte „starke CH“ (nämlich CH10-11 und CH4-5 für NBD1 bzw. NBD2) mehr Kontakt mit dem NBD und für diesen ist die „Kugelgelenk“-Anordnung deutlich ausgeprägter ausgeprägter als beim „schwachen CH“. Interessanterweise weist die NBD1-Sequenz in MRP1 von Säugetieren eine Deletion von 13 Aminosäuren auf, die mit weniger Kontakten und deutlich schwächeren Wechselwirkungen zwischen CH2-3 und CH10-11 im Vergleich zu CH4-5 und CH8-9 für NBD2 verbunden ist (ergänzende Abbildung 18). ). Darüber hinaus sind die wenigen zwischen CH2-3 und CH10-11 beobachteten Kontakte in Gegenwart von ATP-Molekülen leicht verringert, während das Kontaktmuster für NBD2, d. h. CH4-5 und CH8-9, unabhängig von der Anwesenheit von ATP und/oder gut erhalten bleibt. oder Leukotrien C4. Dies führt zu einer Störung der sogenannten „Kugel-und-Sockel“-Anordnungen von CH2-3 und CH10-11 in NBD1, von denen erwartet wird, dass sie (i) für die oben erwähnte asymmetrische Öffnung des NBD verantwortlich sind und (ii) diese verhindern Informationsübertragung zwischen TMDs und NBD18.

IF-Konformationen zeigten schwächere NBD-Dimer-Wechselwirkungen als OF-Konformationen, was die insgesamt größere Flexibilität erklärt. Ebenso zeigten MD-Simulationen eine etwas höhere Flexibilität des IF-Apo-Zustands im Vergleich zu ATP- und/oder LTX-gebundenen Systemen. Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen, die darauf hindeuten, dass Wechselwirkungen zwischen TMHs oder zwischen NBDs durch die Anwesenheit von Substrat- und/oder ATP-Molekülen moduliert werden4,7,8,22. Unter Nutzung unserer umfangreichen unvoreingenommenen MD-Simulationen wurden erforschte Konformationsunterräume anhand der freien Energie mithilfe der InfleCS-Clustering-Methoden 23 untersucht (Abb. 2b). Angesichts der oben erwähnten inkompetenten NBD-Dimer-Konformationen wurde der Schwerpunkt auf NBD-Strukturparameter gelegt, nämlich NBD-Twist und NBD-Abstand. Es wurden größere Variabilitäten für IF-Konformationen beobachtet, die zu mehreren plausiblen Minima führten, für die eine gegenseitige Umwandlung möglich, aber langsam ist. Der voraussichtlich kompetente Unterraum NBD-Twist versus NBD-Distanz wird in der Regel in Gegenwart von ATP-Molekülen und/oder Substraten besiedelt. Dieser Befund unterstreicht die zentrale Rolle von ATP- und Substratbindungsereignissen im ABCC1-Transportzyklus. Um die Dynamik des NBD-Dimers besser zu entschlüsseln, wurden strukturelle Netzwerke24 unter Berücksichtigung sowohl von Kontaktkarten (ergänzende Abbildung 19) als auch dynamischer Kreuzkorrelationsmatrizen (ergänzende Abbildung 20) erhalten. Jede NBD kann unabhängig von der Konformation oder den durch ATP-Bindung gesteuerten Bindungszuständen global in zwei Subdomänen aufgeteilt werden (ergänzende Abbildung 21). Tatsächlich waren ähnliche sogenannte Gemeinschaften gegenüber den Replikaten und den untersuchten Systemen relativ gut konserviert (Ergänzungstabelle 6). Die erste Community wird durch Walker A und B sowie A- und H-Loops definiert. Andererseits umfasst die zweite Community Q- und X-Loops sowie die ABC-Signatursequenz. Die in diesen Gemeinschaften beteiligten Reste sind stark korreliert, was darauf hindeutet, dass sich die lokale Verdrängung von Resten durch die ATP-Bindung ausbreitet. Die beiden Gemeinschaften können als nahezu unabhängig betrachtet werden; Daher wird nicht erwartet, dass die Bindung eines ATP die Bewegungen der zweiten Gemeinschaft stark beeinflusst. Angesichts der asymmetrischen NBD-Dimeranordnung wird erwartet, dass ATP und Magnesium Gemeinschaften über NBDs hinweg verbinden. Interessanterweise zeigten dynamische Korrelationen in IF-Apo-Simulationen größere Variabilitäten, da Gemeinschaften in Untergemeinschaften aufgeteilt werden konnten (Ergänzungstabelle 7), sodass erwartet wird, dass die ATP-Bindung die strukturelle Zusammenarbeit innerhalb und zwischen NBDs stärkt.

Besonderes Augenmerk wurde auf die Bindungsmodi von ATPs gelegt, indem Van-der-Waals- und Coulomb-Potentiale sowie H-Brückennetzwerke in den NBSs bewertet wurden (Abb. 2c, d). Aufgrund der Kompensation von Fehlern zwischen den beiden Potenzialen, insbesondere bei kurzen Distanzen, sollten solche Analysen nicht quantitativ betrachtet werden25. Sie können jedoch verwendet werden, um qualitative Hinweise zu liefern, um die Triebkräfte der ATP-Bindung zu vergleichen. Interessanterweise zeigten sowohl Coulomb- als auch dispersive Wechselwirkungen für alle IF-Konformationen weniger attraktive Energien als OF-Konformationen. Da NBDs eine geringere Flexibilität in der OF-Konformation aufweisen, können die daraus resultierenden engeren NBD-Dimer-Wechselwirkungen durch die richtige lokale Anordnung der ATP-Moleküle in NBSs erklärt werden. Beispielsweise waren die berechneten niedrigeren π-Stapelabstände zwischen ATP-Molekülen und NBS-konservierten Motiven in IF-Konformationen systematisch größer als in OF-Konformationen, was zu niedrigeren Wechselwirkungsenergien zwischen ATP-Molekülen und MRP1-Resten führte (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 8). Überraschenderweise zeigt NBS1 in IF-Konformationen im Vergleich zu Tyr1301 in der NBS2-A-Schleife tendenziell geringere dispersive Wechselwirkungen zwischen dem ATP-Molekül und dem Trp653-A-Schleifenrest, während die räumliche aromatische Oberfläche von Tryptophan größer ist als für Tyrosin. Andererseits sind in der OF-Konformation die dispersiven Beiträge für NBS1 tendenziell etwas größer als für NBS2. H-Brückennetzwerke zwischen ATP-Molekülen und NBSs (Abb. 2d) lassen auf ein ähnliches Netzwerk zwischen NBSs für IF-Konformationen schließen. Das H-Brücken-Netzwerk bleibt hinsichtlich der Wechselwirkungen mit Walker A über IF- und OF-Konformationen erhalten; Allerdings weisen ATP-gebundene IF-Systeme nicht das erwartete H-Brückennetzwerk mit dem Signaturmotiv auf, wie es in OF-Simulationen beobachtet wurde. Interessanterweise deuten MD-Simulationen auf ein asymmetrisches Verhalten zwischen NBS in Bezug auf H-Bindungen mit Q-Loop-Glutaminresten hin, nämlich Gln713 und Gln1374 für NBS1 bzw. NBS2. Berechnete Abstände deuteten darauf hin, dass die Bindung von ATP-γ-Phosphat an die NBS1-Q-Schleife schwächer war als für NBS2 in der OF-Konformation. Das gegenteilige Verhalten wurde in MD-Simulationen für IF-Konformationen beobachtet. Daher unterstreichen die vorliegenden Simulationen, dass die richtigen ATP-Bindungsmodi in beiden NBSs der Schlüssel zum Auslösen von Konformationsänderungen sind, die für die Substrattranslokation erforderlich sind.

Besonderes Augenmerk wurde auf die Substratbindungstasche gelegt und diese mit der Kryo-EM-Struktur von an Leukotrien C48 gebundenem bMRP1 verglichen. In Übereinstimmung mit Experimenten fand der Leukotrien-C4-Bindungsmodus in den beiden sogenannten P- und H-Taschen statt („P“ und „H“ stehen jeweils für polar und hydrophob). Aufgrund der amphiphilen Eigenschaft von Leukotrien C4 haben sich Coulomb- und H-Brücken-Netzwerke als zentral für die Substratbindung erwiesen8. MD-Simulationen hoben dieselben Schlüsselreste hervor, die experimentell beobachtet wurden (Abb. 2d). Beispielsweise wurden starke Salzbrücken zwischen Argininresten (Arg1248, Arg1196 und Arg593, Abb. 2d und 3a) beobachtet, die mindestens zwei der drei Leukotriencarboxylatgruppen in der P-Tasche beibehalten. Interessanterweise deuten Schwankungen in Bezug auf H-Brückenanteile oder Wechselwirkungsenergien (Abb. 2d und ergänzende Abb. 22) auf einen dynamischen Bindungsmodus hin, der mit dem erwarteten Bruch entlang der großräumigen Konformationsänderungen von IF zu OF übereinstimmt.

Eine Substratbindungstasche hebt wichtige Rückstände für die Leukotrien-C4-Bindung hervor. Es wird auch die Struktur von Leukotrien gezeigt, bei der amphiphile Merkmale hervorgehoben werden. b Definition des in der vorliegenden Studie untersuchten allosterischen Signalwegs, für den NBS1 und NBS2 getrennt behandelt wurden. c Berechnete allosterische Effizienzen des Informationsflusses zwischen der Substratbindungstasche und NBS1 (rot) oder NBS2 (blau) für die verschiedenen Systeme, die in POPC:POPE:Chol (2:1:1) eingebettet sind. Durchgezogene, gestrichelte und gepunktete Linien stellen jeweils die Effizienz unter Berücksichtigung von Protein + Lipiden + Nukleotiden/Substrat, Protein + Nukleotiden/Substrat und eigenständigem Protein dar. Standardfehler werden als Schattierungen angezeigt und aus n = 3 Replikaten berechnet, die für jedes System unabhängig behandelt wurden. d Protein- und E-Lipid-Beiträge zum Informationsfluss für die allosterische Kommunikation von der Substratbindungstasche zu NBS1 und NBS2 zeigen, dass NBD2 und seine Kopplungshelices (CH4-5 und CH8-9) unabhängig von der Senkenregion systematisch beteiligt sind.

Auch wenn die Unterschiede in Bezug auf Wechselwirkungsenergien und H-Brückennetzwerke zwischen bMRP1-LTX-(ATP)2 und bMRP1-LTX oder bMRP1-(ATP)2 gering blieben, deuten sie auf einen Ferneffekt zwischen NBSs und der Substratbindungstasche hin. Der allosterische Effekt wurde unabhängig voneinander zwischen der Substratbindungstasche und NBS1 und NBS2 bewertet (Abb. 3b). Dies wurde erreicht, indem Schlüsselreste für jede Bindungsstelle (Ergänzungstabelle 9) für allosterische Signalwegnetzwerkanalysen berücksichtigt wurden 26, 27. Effizienzen (Abb. 3c) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Substrat- und ATP-Molekülen berechnet. Der Einfluss der Lipiddoppelschicht POPC:POPE:Chol (2:1:1) wurde ebenfalls berücksichtigt. Substratbindungstaschen und NBSs sind nativ über das Protein allosterisch verbunden, wie berechnete Effizienzen ohne Einbeziehung von Nukleotiden oder Substraten zeigen. Wie erwartet erhöhte das Vorhandensein von Substrat- und/oder ATP-Molekülen die allosterische Kommunikation von der Substratbindungstasche zu beiden NBSs erheblich. Interessanterweise zeigten die vorliegenden Berechnungen trotz der oben erwähnten asymmetrischen NBD-Dynamik keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Effizienz zwischen NBSs. Zwischenräume wurden berechnet, um die Rest- und Domänenbeiträge zum allosterischen Weg darzustellen (Abb. 3d und ergänzende Abb. 23–25). Besonderes Augenmerk wurde auf ATP-gebundene Systeme gelegt, d. h. IF bMRP1-(ATP)2 und bMRP1-LTX-(ATP)2 sowie OF bMRP1-(ATP)2 (Abb. 4d), über andere Systeme wird berichtet Ergänzende Abbildung 26. Die Hauptreste, die an den allosterischen Bindungstaschen-NBS-Wegen beteiligt sind, befinden sich größtenteils im intrazellulären Teil von TMHs. Interessanterweise wurde erneut ein asymmetrisches Verhalten beobachtet, an dem TMH4, TMH5, TMH7 und TMH8 deutlich stärker beteiligt sind als TMH1, TMH2, TMH10 und TMH11. bMRP1 weist ein asymmetrisches Merkmal in Bezug auf die sogenannten „Kugel-und-Sockel“-Anordnungen auf, die nachweislich für die strukturelle Zusammenarbeit zwischen TMHs und NBDs durch Kopplungshelices verantwortlich sind8. Die Deletion von dreizehn Aminosäuren in NBD1 führt zu einer geringeren Kooperation zwischen TMH1, TMH2, TMH10 und TMH11 mit NBD1, was wiederum die allosterische Kommunikation zwischen der Substratbindungstasche und NBS1 verringert. Darüber hinaus deuten unsere Berechnungen darauf hin, dass Informationen größtenteils über NBD2 laufen, da die direkte Kommunikation mit NBD1 durch das Fehlen einer „Kugel-und-Sockel“-Konformation für CH10-118 deutlich geschwächt ist. Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass die POPC:POPE:Chol-Lipiddoppelschicht eine Schlüsselrolle bei der allosterischen Kommunikation zwischen Substratbindungstasche und NBSs spielt (Abb. 3c). Obwohl die Auswirkungen erheblich sind, schienen die Beiträge der Lipiddoppelschicht milder zu sein als z. B. bei Membrantransportern der Major Facilitator Superfamily28.

a Durchschnittlicher IC-Winkel, EC-Winkel und NBD-Abstand für alle bMRP1-Systeme, die in verschiedene Lipiddoppelschichten eingebettet sind, berechnet aus n = 3 MD-Trajektorien pro Zustand und Lipiddoppelschicht. Der Fehlerbalken bezieht sich auf die Standardabweichungen jedes Datensatzes. b Berechnete C-Atom-Lipid-Schwanzordnungsparameter (SCD) für Palmitin- (sn1) und Ölsäureschwänze (sn2) für alle Systeme, die in POPC-basierten Modellen eingebettet sind. Durchgezogene, gestrichelte und gepunktete Linien stellen jeweils Parameter der Lipidordnung dar, die in den Lipiddoppelschichtmodellen POPC:POPE:Chol (2:1:1), POPC:Chol (3:1) und POPC erhalten wurden. Der Fehlerbalken bezieht sich auf die Standardabweichungen jedes berechneten Datensatzes. c Berechnete Verformungen der freien Energie der Membran30, erhalten durch Mittelung über n = 3 MD-Trajektorien, wobei jede Replik einzeln betrachtet wurde. Rohdaten sind in den Ergänzungstabellen 10–12 verfügbar. Fehlerbalken beziehen sich auf die Standardabweichung über die drei unabhängigen Replikate. d Berechnete Bindungs-Hotspots aus Cholesterin und PE-Lipiden, definiert durch eine Anwesenheitswahrscheinlichkeit von mehr als 80 bzw. 50 % für Cholesterin und PE-Lipide. Beim Zoomen auf Cryo-EM-aufgelöstes Cholesterin (violett) wird die spezifische parallele Ausrichtung in Bezug auf die Lipiddoppelschicht hervorgehoben. e Wichtige Lipidbereiche basierend auf der allosterischen Signalweganalyse. Die Position der wichtigsten Cholesterinmoleküle, die an der allosterischen Kommunikation zwischen Substratbindungstasche und NBS beteiligt sind, wird gezeigt. Beide NBS werden berücksichtigt, was die erwartete zentrale Rolle der L0-, Prä-TMH1- und Prä-TMH7-Regionen bei spezifischen Lipid-Protein-Wechselwirkungen hervorhebt, die die bMRP1-Funktion begünstigen könnten.

Da heutzutage dem Zusammenspiel zwischen der umgebenden Lipidumgebung11,19,22,26,28 und Membranproteinen mehr Aufmerksamkeit geschenkt wird, wurden lipidabhängige Proteindynamik und Lipid-Protein-Wechselwirkungen untersucht. Dies wurde durch die Durchführung von MD-Simulationen in verschiedenen Lipiddoppelschichten erreicht, nämlich POPC, POPC:Chol (3:1), POPC:POPE:Chol (2:1:1). IF-Apo-bMRP1- und OF-bMRP1-(ATP)2-Systeme wurden auch in unrealistischen POPE- und POPC:POPE (3:1)-Lipiddoppelschichten berücksichtigt.

Die Projektion lipidabhängiger Strukturparameter auf den ABC-Konformationsraum (Ergänzende Abbildungen 1, 27 und 28) ergab, dass die meisten der vorliegenden Simulationen dazu neigen, ähnliche ABC-Unterräume unabhängig von der Zusammensetzung der Lipiddoppelschichtmembran zu untersuchen. Abbildung 4a vergleicht die Strukturparameterdurchschnitte entsprechend der Zusammensetzung der Lipiddoppelschicht für alle in der vorliegenden Studie durchgeführten MD-Simulationen. Bei den IF-Konformationen zeigten nur intrazelluläre Strukturparameter (z. B. IC-Winkel und NBD-Abstand) geringfügige Abweichungen entsprechend der Lipidzusammensetzung. Systeme, die in einer reinen POPC-Lipiddoppelschicht durchgeführt wurden, zeigten etwas offenere Konformationen. Andererseits legen unsere Berechnungen nahe, dass nur der EC-Winkel von der Zusammensetzung der Lipiddoppelschicht beeinflusst wird, jedoch nur für OF-Konformationen. Ebenso zeigten die berechneten Hohlraumradien (ergänzende Abbildung 9) beim Vergleich der Lipiddoppelschichtzusammensetzungen kleine Unterschiede. Auch wenn diese Berechnungen beim Vergleich von bMRP1-Strukturen in verschiedenen Lipiddoppelschichtmodellen einen relativ begrenzten Gesamteinfluss der Membranzusammensetzung unterstreichen, haben sie die dynamische Variabilität gegenüber MD-Simulationen und Replikaten nicht ausreichend abgebildet (Ergänzende Abbildungen 1–6 und 9).

Lipidabhängige Konformationslandschaften wurden berechnet (Ergänzende Abbildungen 29 und 30). Für eine gegebene Konformation und einen gegebenen Bindungszustand besiedelten MD-Simulationen unabhängig von der Lipidzusammensetzung bevorzugt ähnliche Regionen. Allerdings wurde gezeigt, dass die strukturelle Variabilität erheblich von der Lipidzusammensetzung beeinflusst wird. Beispielsweise wurden in der reinen POPC-Lipiddoppelschicht offenere IF-Konformationsunterräume im Bereich von 30 bis 55 Å NBD-Abstand untersucht. Dieser Effekt wurde jedoch in Gegenwart von Substrat verringert, von dem erwartet wird, dass es tendenziell mehr Kontakte zwischen TMHs aufrechterhält und somit die intrazelluläre Öffnung verringert. MD-Simulationen, die mit POPC:POPE:Chol (2:1:1) durchgeführt wurden, zeigten einen deutlich kleineren Probenbereich, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von PE-Lipiden dazu neigt, das intrazelluläre Tor der bMRP1-IF-Konformationen zu schließen, unabhängig vom gebundenen Zustand. Andererseits wurden in Bezug auf OF-Konformationen und extrazelluläre Öffnung interessante globale Minima im gleichen Unterraum des Konformationsraums beobachtet wie MD-Simulationen, die in reinem POPC und POPC:Chol (3:1) durchgeführt wurden. Dies deutet auf einen begrenzten Einfluss von Cholesterin auf die Öffnung des bMRP1-EC-Tors hin. Allerdings verschob die Anwesenheit von PE-Lipiden die berechneten Minima leicht in Richtung offenerer OF-Strukturen, von 13,9 auf 18,5°. Neigungswinkel zwischen TMHs und der normalen Lipiddoppelschicht wurden gemessen, um geringfügige Unterschiede zwischen den verschiedenen Lipiddoppelschichtzusammensetzungen aufzudecken (ergänzende Abbildung 31). Auch wenn aus diesen Analysen keine klaren Schlussfolgerungen gezogen werden können, schienen die Orientierungen von TMH3, TMH6 und TMH9 in Abwesenheit von Cholesterin empfindlicher zu sein. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass TMHs wie für ABCB1/P-gp18 gezeigt als Bündel wirken, war der Einfluss der Lipiddoppelschichtmembran auf die Neigungsausrichtungen gegebener kleinerer Bündel stärker ausgeprägt (ergänzende Abbildung 32), nämlich Bündel C und D, die jeweils aus TMH3/ TMH6 und TMH9/TMH12. Interessanterweise wird erwartet, dass diese Bündel während des Transportzyklus größere Konformationsänderungen erfahren18. Dies deutet darauf hin, dass, obwohl die Lipidzusammensetzung beim Vergleich der Strukturen der lokalen bMRP1-Minima in verschiedenen Lipiddoppelschichtmembranen einen eher begrenzten Einfluss zu haben scheint, erwartet wird, dass die Lipidzusammensetzung Konformationsübergänge beeinflusst und somit wiederum eine Rolle bei der Kinetik des Substrats spielt Transport durch bMRP1.

Um das Zusammenspiel zwischen der Lipiddoppelschicht und bMRP1 besser zu verstehen, wurde besonderes Augenmerk auf die Membranstruktur der Lipiddoppelschicht gelegt. Die größere strukturelle Variabilität in der reinen POPC-Membran wurde durch eine deutlich flüssigere Lipiddoppelschichtstruktur erklärt, die durch Parameter niedrigerer Ordnung (SCD) für Palmitat- und Oleatschwänze dargestellt wird (Abb. 4b). Im Einklang mit der Biophysik reiner Lipiddoppelschichten moduliert das Vorhandensein von Cholesterin die Fließfähigkeit von POPC durch Erhöhung der Lipidordnung, was wiederum zu einer geringeren Flexibilität der Lipiddoppelschichtmembran führte29. In geringerem Maße verstärkte das Vorhandensein von PE-Lipid die strukturelle Wirkung von Cholesterin, was mit der etwas geringeren strukturellen Variabilität von bMRP1 in POPC:POPE:Chol (2:1:1) im Vergleich zu anderen Lipiddoppelschichtmembranen übereinstimmt. Berechnungen der Lipidordnung deuten auch auf einen schwachen Einfluss der Proteindynamik auf Lipiddoppelschichtstrukturen hin. Tatsächlich zeigten IF-apo- und OF-bMRP1-(ATP)2-MD-Simulationen etwas weniger geordnete Lipidschwanzprofile als IF-bMRP1-LTX, bMRP1-(ATP)2 und bMRP1-LTX-(ATP)2. Dies kann durch eine größere Variabilität der intrazellulären und extrazellulären Öffnungen für die IF- bzw. OF-Konformation erklärt werden, was wiederum wahrscheinlich zu stärkeren Verschiebungen der umgebenden Lipide führt. Verformungen der freien Energie der Membran 30 wurden ebenfalls bewertet, um den Einfluss von bMRP1-Konformationen auf Lipiddoppelschichtstrukturen zu dokumentieren (Ergänzungstabellen 10–12 und Abb. 4c). Während Berechnungen darauf hindeuten, dass die Anwesenheit von bMRP1 die Struktur der reinen POPC-Lipiddoppelschicht destabilisiert, wurde interessanterweise der gegenteilige Trend bei POPC:POPE:Chol (2:1:1) beobachtet, bei dem die Membran in Gegenwart von bMRP1 stabilisiert wird (ΔGdeformation < 0, siehe Abb . 4c). Ein intermediäres Verhalten wurde in der POPC:Chol (3:1)-Lipiddoppelschichtmembran beobachtet, bei der das Vorhandensein von bMRP1 die Lipiddoppelschichtstruktur insgesamt destabilisierte, jedoch in deutlich geringerem Ausmaß als in reinem POPC. Mit Ausnahme von Simulationen, die in einer reinen POPC-Lipiddoppelschicht durchgeführt wurden, sind die berechneten freien Verformungsenergien für den IF-apo-bMRP1-Zustand größer als für andere Konformationen, was wahrscheinlich auf die oben erwähnte größere Flexibilität in Abwesenheit von ATP und/oder Substrat zurückzuführen ist.

Lipidabhängige zweidimensionale Dichteanalysen sowie die Beurteilung der Verteilung der umgebenden Lipide deckten wichtige Cholesterin- und PE-Lipid-Hotspots auf. Beispielsweise wurde gezeigt, dass PE-Lipide in mehr als 50 % der Simulation bevorzugt an die Pre-TMH7-Ellbogenhelix sowie in der Nähe der L0-Domäne binden (Abb. 4d, berechnete 2D-Dichteprofile in den ergänzenden Abbildungen 33–36). . Elektronendichtekarten zeigten drei Cholesterinmoleküle, die an die aufgelöste OF-bMRP1-Struktur gebunden waren, von der zwei mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 50 % in der Nähe ihrer ursprünglichen Position gehalten wurden (ergänzende Abbildung 33). Interessanterweise bleibt eine von Pre-TMH7 entlang der MD-Simulationen stark (mehr als 80 %) erhalten und ist entlang der Pre-TMH7-Ellbogenhelix ausgerichtet, dh parallel zur Lipiddoppelschicht (Abb. 4d). Dieser Cholesterin-Hotspot vor TMH7 wurde beispielsweise auch in IF-apo-POPC:POPE:Chol-Simulationen (2:1:1) beobachtet (Abb. 4c). In geringerem Maße bleibt ein zweites aufgelöstes Cholesterinmolekül über die Ellbogenhelix vor TMH1 mit dem Protein in Kontakt (ergänzende Abbildung 33). Interessanterweise wurde dieser im Vergleich zur Ellbogenhelix vor TMH7 nahezu pseudosymmetrische Hotspot auch in Simulationen beobachtet, die mit IF-bMRP1-Konformationen durchgeführt wurden (Abb. 4d). Allosterische Signalweganalysen unterstrichen die Schlüsselrolle von Cholesterinmolekülen in der Nähe der Pre-TMH1- und -TMH7-Ellenbogenhelices bei der Informationsübertragung von der Substratbindungstasche zu NBSs, wie in Abb. 4e dargestellt. Tatsächlich deutet die berechnete Beziehung zwischen diesen Cholesterinmolekülen eindeutig darauf hin, dass sie aktiv an der allosterischen Kommunikation von der Substratbindungsstelle zu den NBSs beteiligt sind. Schließlich bleibt das letzte gelöste Cholesterinmolekül, das an der Grenzfläche zwischen TMH5 und TMH8 beobachtet wird, bei MD-Simulationen nicht in Kontakt mit dem Proteinkern. Berechnete 2D-Dichteprofile von Cholesterin deuten jedoch auf eine etwas höhere Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Cholesterin in dieser Region hin, was darauf hindeutet, dass das aufgelöste Molekül entlang der MD-Simulation ausgetauscht wurde. Darüber hinaus zeigten solche Profile auch Flecken mit höherer Dichte, wie beispielsweise das horizontal ausgerichtete Cholesterinmolekül von TMH4 (Ergänzende Abbildungen 35–36).

bMRP1 ist das einzige Mitglied der C-Familie der ABC-Arzneimittelexporteure, das bisher durch Kryo-EM aufgeklärt werden konnte, da ABCC7/CFTR ein Chloridkanal ist31 und Sulfonylharnstoffrezeptoren (ABCC8 und ABCC9) an der Regulierung von Kaliumkanälen beteiligt sind32. Im letzten Jahrzehnt wurde den MRP-Transportern, einschließlich MRP1, MRP2 und MRP4, besondere Aufmerksamkeit gewidmet, da sie laut ITC eine klinisch und pharmakologisch relevante Rolle bei der Arzneimitteldisposition spielen12,13. Im Gegensatz zu seinem Cousin ABCB1/P-gp ist das Wissen über die Dynamik und Funktionen von MRP1 immer noch fragmentiert, obwohl es in mehreren Zuständen aufgelöst wurde, wie z. B. IF-Apo- und substratgebundenen Zuständen8 und zwei OF-Zuständen unter Prä-4 und Post-Hydrolyse5 Konformationen, die entweder an zwei ATP-Moleküle oder an ein ADP/ATP-Paar gebunden sind. In der vorliegenden Arbeit wurde eine umfangreiche Reihe von Allatom-MD-Simulationen durchgeführt, um die Konformationsdynamik von bMRP1 in verschiedenen Zuständen unter Berücksichtigung verschiedener Mischungen von Lipiddoppelschichtmodellen, einschließlich PC- und PE-Lipiden sowie Cholesterin, zu erfassen. Wir schlagen einen MD-basierten rechnerischen Ansatz vor, um (i) die experimentellen Beobachtungen in Waschmitteln zu vervollständigen und (ii) Strukturmuster hervorzuheben, die zumindest auf andere Transporter der ABC-C-Familie ausgeweitet werden könnten.

Die globale Konformationsdynamik in POPC:POPE:Chol (2:1:1) zeigt signifikante Variationen der IF-Strukturen im Vergleich zu Kryo-EM-Strukturen. In IF-Zuständen wurde das spontane Schließen von NBDs systematisch beobachtet, unabhängig von der Anwesenheit von ATP-Molekülen, wie durch IC-Winkel- und NBD-Abstandswerte dargestellt, die alle in Richtung desselben Unterraums konvergierten. In Bezug auf den ABC-Konformationsraum verschiebt das Vorhandensein von ATP-Molekülen in beiden NBSs oder von Substrat in der TMD-Bindungstasche größtenteils die Dynamik der NBD-Dimerisierung durch Modulation des NBD-Twist-Werts (Abb. 2b und ergänzende Abb. 5). Daher stimmen unsere MD-Simulationen perfekt mit jüngsten Beobachtungen6,7 überein, dass weit offene IF-Strukturen in nativen Membranumgebungen möglicherweise unwahrscheinlich sind. Es wird daher angenommen, dass weit offene Strukturen, die in Kryo-EM-Experimenten beobachtet wurden, auf Artefakte zurückzuführen sind, die auf die Verwendung nicht-physiologischer Umgebungen zur Strukturauflösung zurückzuführen sind7, was mit strukturellen Unterschieden übereinstimmt, die beispielsweise für P-gp beobachtet wurden, das entweder in Detergenzien oder in Nanoscheiben rekonstituiert wurde11 . Die Deletion von 13 Aminosäuren in NBD1, beispielsweise das Fehlen der „Kugel-und-Sockel“-Struktur für NBD1, könnte die Kopplung zwischen NBD1 und TMH10/TMH11 schwächen. In Abwesenheit eines Substrats ist dies mit einer größeren Translationsflexibilität in Bezug auf NBD1 verbunden, was zur Öffnung des NBD-Dimers führt. In Gegenwart von ATP-Molekülen und Substrat wurden jedoch nur enge NBD-Dimerkonformationen beobachtet (Abb. 2a), was die allosterische Kommunikation zwischen TMDs und beiden NBSs hervorhebt. Aufgrund der geringeren Kopplung zwischen TMH10/TMH11 und NBD1 wird erwartet, dass die Allosterie zwischen TMDs und NBDs hauptsächlich durch NBD2 vermittelt wird. Interessanterweise wurde NBS1 auch in Abwesenheit von ATP-Molekülen gebildet (Abb. 2a). Dies könnte auch erklären, warum IF-zu-OF-Übergänge experimentell auch in Abwesenheit von ATP-Molekülen beobachtet wurden5. Solche Annahmen sollten jedoch angesichts der kürzlich erfolgten Auflösung eines NBS-degenerierten ABC-Transporters, der mittels Kryo-EM unter Verwendung von Nanokörpern eine weit offene IF-Konformation annimmt, sorgfältig geprüft werden33. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der NBD- und NBS-Asymmetrie als Weiterentwicklung von ABC-Transportern, die aus Energieeinsparungen bei gleichzeitiger Beibehaltung der Transportfunktion resultieren kann, da eine einzige ATP-Hydrolyse erforderlich ist.

Es wird erwartet, dass MRP1 hauptsächlich anionische amphiphile Substrate transportiert, im Gegensatz zu P-gp, das hauptsächlich hydrophobe Substrate transportiert2. In Übereinstimmung mit strukturellen Beobachtungen ist ein direkter Substratzugang aus Lipidschwanzregionen der Membran mit hoher oder niedriger Dichte sehr unwahrscheinlich, da im Gegensatz zu P-gp8 kein Zugangskanal in der Lipiddoppelschicht vorhanden ist. Amphiphile Substrate könnten sich jedoch in der Polkopfregion mit hoher Dichte aufteilen. Daher wird erwartet, dass der Zugang zum MRP1-Substrat entweder direkt vom Zytoplasma oder von der Polkopfregion mit hoher Dichte erfolgt, wobei der Zugang möglicherweise über TMH4 und TMH6 möglich ist (ergänzende Abbildung 37). Auf der anderen Seite von bMRP1 deuten unsere MD-Simulationen darauf hin, dass der Substratzugang zwischen TMH10 und TMH12 bei sperrigen Substraten weniger wahrscheinlich ist. Allerdings erfordern solche Annahmen weitere biochemische und strukturelle Untersuchungen.

In der vorliegenden Arbeit haben wir auch das Zusammenspiel zwischen Lipiddoppelschichtmembranen und Proteindynamik untersucht. Zunächst ist es wichtig zu beachten, dass die vorliegenden Simulationen für jedes Replikat einige μs lang durchgeführt wurden. Angesichts der Zeitskala von Transportprozessen können die vorliegenden Ergebnisse nur dazu verwendet werden, das Lipid-Protein-Wechselspiel in den Gleichgewichtsbereichen der verschiedenen Konformationszustände zu entschlüsseln. Durch das Spielen mit verschiedenen Lipiddoppelschichtmodellen wie cholesterinfreien und PE-freien Membranen wird die bMRP1-Dynamik moduliert. Im Einklang mit früheren biophysikalischen Studien erhöhte das Vorhandensein von Cholesterin in PC-basierten Membranen die Membransteifigkeit, was wiederum die Konformationsdynamik von MRP129 verringerte. Es wird erwartet, dass der Einfluss von PE-Lipiden auf lokale Minimalstrukturen für IF-Zustände eher begrenzt ist. Interessanterweise schien die EC-Öffnung unter OF-Konformation jedoch in Gegenwart von PE günstiger zu sein (Abb. 4a). Insgesamt deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass die MRP1-Struktur für einen bestimmten Zustand wahrscheinlich eine ähnliche Struktur annimmt, unabhängig von der Zusammensetzung der Lipiddoppelschicht. Dies könnte jedoch bei Konformationsübergängen und der Kinetik eine Rolle spielen. Diese Hypothese sollte für andere MRP-Transporter sorgfältig geprüft werden. Tatsächlich ist MRP1 im Gegensatz zu beispielsweise MRP2 und MRP4 ein allgegenwärtiger Exporter, der in verschiedenen Zelltypen beobachtet wurde, bei denen die Zusammensetzung der Lipiddoppelschicht unterschiedlich sein könnte. Wir können daraus schließen, dass andere MRP-Mitglieder möglicherweise empfindlicher auf Lipiddoppelschichtmembranzusammensetzungen reagieren.

Abgesehen von der physikalischen Rolle der Lipiddoppelschicht auf die Proteindynamik belegen unsere Ergebnisse, dass Lipidkomponenten auch eine aktive Rolle bei der Transporterfunktion spielen. Im Einklang mit rechnerischen Beobachtungen an anderen Membranproteinen11,26,34,35 sind Lipidkomponenten an der Allosterie von TMDs zu NBDs beteiligt. Noch wichtiger ist, dass die Bindung von Cholesterin an Pre-TMH1- und Pre-TMH7-Ellenbogenhelices stark an diesen allosterischen Signalwegen beteiligt ist. Solche Erkenntnisse ebnen den Weg für die Rolle des Lasso-Prä-TMD-Motivs (L0), das nachweislich für die MRP1-Transportfunktion erforderlich ist8,17. Auch wenn die Rolle von Lipiden bei MRP1 im Vergleich zu anderen Membranrezeptoren und -kanälen begrenzt erscheint, sollte den Lipid-Protein-Wechselwirkungen mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden, nicht nur im Hinblick auf die biophysikalischen Auswirkungen auf die Proteindynamik, sondern auch als Transportmodulator, wie kürzlich vorgeschlagen P-gp11.

Die vorliegende Arbeit lieferte strukturelle Einblicke in die Funktion und das Lipid-Protein-Wechselspiel von NBS-degenerierten ABCC-Transportern für weitere Untersuchungen wie die Rolle von MRPs in der lokalen Pharmakokinetik, einschließlich z. B. der Auswirkungen seltener Mutationen/Polymorphismen sowie krankheitsbedingter Membranen Lipid-Ungleichgewicht hin zu personalisierter Medizin.

Um einen Überblick über Meilensteinstrukturen entlang des Transportzyklus von bMRP1 zu erhalten, wurden in der vorliegenden Studie verschiedene Konformationen und Bindungszustände berücksichtigt: IF apo bMRP1, IF bMRP1-(ATP)2, IF bMRP1-LTX, IF bMRP1-LTX- (ATP)2 und OF bMRP1-(ATP)2. Die Kryo-EM-Strukturen wurden als Ausgangsstrukturen für IF- (PDB-ID: 5UJ98 und 5UJA8) und OF-Konformationen (PDB-ID: 6BHU4) verwendet. Die OF-Konformation wurde mithilfe der E1454Q-Mutante aufgelöst, die nachweislich die Rate der ATP-Hydrolyse senkte und so die OF-Strukturbestimmung förderte4. Diese Mutation wurde für die vorliegende Studie manuell rückgängig gemacht. Das sogenannte TMD0 wurde in den vorliegenden Modellen nicht berücksichtigt, da bereits gezeigt wurde, dass es den Substrattransport nicht beeinflusst3,4,8. Es wurde jedoch gezeigt, dass die sogenannte Prä-TMH1-Lassodomäne (L0) für die MRP1-Funktion zwingend erforderlich ist, während sie in keiner Kryo-EM-MRP1-Struktur vollständig aufgelöst wurde8,17. Fehlende Teile der L0-Domäne wurden entweder mit I-Tasser (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) server36 oder Modeller v9.2337 für IF- bzw. OF-Konformationen modelliert. Tatsächlich gelang es I-Tasser zunächst nicht, im Vergleich zum IF-Modell eine konsistente L0-Domäne für den OF-bMRP1-(ATP)2-Zustand vorherzusagen. Aus Konsistenzgründen wurde die OF bMRP1-(ATP)2 L0-Domäne daher mit dem Modeller v9.23 basierend auf der Sequenz, aber auch dem IF L0-Domänenmodell als Vorlage erstellt (Ergänzungstabelle 13). Um die Konsistenz zwischen L0-Domänenmodellen sicherzustellen, wurden Struktur und Dynamik durch die Bewertung von RMSF gegenüber MD-Simulationen überwacht, aber auch durch den Vergleich endgültiger L0-Domänenmodellstrukturen, die zu ähnlichen Sekundärstrukturen konvergierten (ergänzende Abbildungen 38 und 39). Ebenso wurde in den vorliegenden Modellen die fehlende Schleife zwischen TMH6 und NBD1 hinzugefügt.

IF-Konformationen wurden in verschiedenen gebundenen Zuständen erstellt, nämlich Apo-, ATP2-, LTX- und LTX-(ATP)2-gebundenen Zuständen, während die OF-Konformation ausschließlich im ATP2-gebundenen Zustand erstellt wurde. IF bMRP1-(ATP)2 und IF bMRP1-LTX-(ATP)2 wurden durch getrennte Überlagerung der NBDs von 5UJ9 bzw. 5UJA auf die NBDs der OF-Konformation konstruiert, in denen sowohl ATP-Moleküle als auch Mg2+ an NBSs gebunden sind. Alle endgültigen Modelle wurden kurz im Vakuum mit dem Amber18-Paket38,39 minimiert, um unphysikalische sterische Konflikte zu vermeiden.

Der CHARMM-GUI-Eingabegenerator40,41 wurde verwendet, um die verschiedenen bMRP1-Modelle in verschiedene Lipiddoppelschichten einzubetten, nämlich reines POPC, POPC:Chol (3:1) und POPC:POPE:Chol (2:1:1), wobei die bMRP1-Koordinaten genutzt wurden entnommen aus der OPM-Datenbank (Orientations of Proteins in Membranes)42. IF apo bMRP1- und OF bMRP1-(ATP)2-Strukturen wurden auch in reine POPE- und POPC:POPE (3:1)-Lipiddoppelschichten eingebettet, um gezielt Lipid-Protein-Wechselwirkungen mit PE-Lipiden zu untersuchen. Die aufgelöste Kryo-EM-Struktur von OF bMRP1-(ATP)2 umfasst auch drei aufgelöste Cholesterinmoleküle, die während aller Simulationen beibehalten wurden, um ihre Bedeutung zu untersuchen. Von diesen unterschiedlichen Lipiddoppelschichtzusammensetzungen schien die POPC:POPE:Chol (2:1:1)-Mischung für die Modellierung von Zellmembranen am relevantesten zu sein. Die anderen Membrantypen sollten dabei helfen, die Rolle jedes Lipids in der Proteindynamik zu verstehen. Die ursprüngliche Gesamtgröße jedes Systems betrug ca. 120 × 120 × 180 Å3 (Systembeschreibungen finden Sie in der Ergänzungstabelle 14). Um physiologische Bedingungen nachzuahmen, wurde 0,15 M NaCl verwendet und die Systeme wurden mit expliziten TIP3P-Wassermolekülen solvatisiert43,44,45. Die endgültigen Systeme bestehen aus ca. 245.000 Atome (siehe Einzelheiten in der Ergänzungstabelle 14).

CHARMM-GUI40,41-Ausgaben wurden mit AmberTools-Skripten38,39 (nämlich charmmlipid2amber.py und pdb4amber) in das Amber-Format konvertiert. In Bezug auf ATP2- und LTX-gebundene Systeme wurden Substrat, Nukleotide und Mg2+-Ionen nach dem Aufbau von Protein-Lipid-Systemen hinzugefügt; Daher wurde die Neutralität durch zufälliges Entfernen der entsprechenden Anzahl von Gegenionen sichergestellt. Amber FF14SB46, Lipid1747 und die modifizierten DNA.OL1548,49-Kraftfelder wurden verwendet, um jeweils Proteinreste, Lipide und ATP-Moleküle zu modellieren. Wassermoleküle, Mg2+-Ionen und Gegenionen wurden mit dem TIP3P-Wassermodell43,44,45 sowie den entsprechenden einwertigen und zweiwertigen Ionenparametern von Joung und Cheatham50,51 modelliert. Die Substratparameter für LTX (Leukotrien C4) wurden aus dem Generalized Amber Force Field Version 2 (GAFF2)52 mithilfe der Antechamber-Software53 abgeleitet. LTX-Teilatomladungen wurden aus quantenmechanischen Berechnungen auf der HF/6-31G*-Theorieebene unter Verwendung des RED-Servers54 abgeleitet. Jedes System wurde mit periodischen Randbedingungen simuliert. Der Grenzwert für nichtgebundene Wechselwirkungen betrug 10 Å sowohl für das Coulomb- als auch für das Van-der-Waals-Potential. Elektrostatische Wechselwirkungen über große Entfernungen wurden mit der Partikelnetz-Ewald-Methode55 berechnet.

Die Minimierung und Thermalisierung der Systeme und MD-Simulationen wurden mit Amber18- und Amber20-Paketen38,39 unter Verwendung von CPU- und GPU-PMEMD-Versionen durchgeführt. Die Minimierung wurde in vier Schritten durchgeführt, indem nacheinander minimiert wurde: (i) Wasser-O-Atome (20.000 Schritte); (ii) alle Bindungen, an denen H-Atome beteiligt sind (20.000 Schritte); (iii) Wassermoleküle und Gegenionen (50.000 Schritte) und (iv) das gesamte System (50.000 Schritte). Jedes System wurde dann in zwei Schritten thermisiert: (i) Wassermoleküle wurden während 50 ps unter (N,V,T)-Ensemble-Bedingungen unter Verwendung einer Zeitintegration von 0,5 fs auf 100 K thermisiert; (ii) Das gesamte System wurde dann während 500 ps unter (N,P,T)-Ensemble-Bedingungen mit einem Zeitschritt von 2 fs unter semiisotropen Bedingungen von 100 K auf 310 K temperiert. Dann wurde jedes System während 5 ns unter (N,P,T)-Ensemble-Bedingungen mit einem Zeitschritt von 2 fs unter semiisotropen Bedingungen unter Verwendung eines Berendsen-Barostaten äquilibriert. Anschließend wurden Produktionsläufe im Mikrosekundenbereich mit einem Integrationszeitschritt von 2 fs unter (N,P,T)-Ensemble-Bedingungen mit semiisotroper Skalierung durchgeführt. Die Temperatur wurde mit dem Langevin-Dynamikthermostat56 mit einer Kollisionsfrequenz von 1,0 ps−1 aufrechterhalten. Der auf 1 bar eingestellte konstante Druck wurde mit semiisotroper Druckskalierung aufrechterhalten, wobei entweder Berendsen-Barostat57 für IF apo bMRP1 und OF bMRP1-(ATP)2 oder Monte-Carlo-Barostat für IF bMRP1-(ATP)2, IF bMRP1-LTX und IF bMRP1 verwendet wurden -LTX-(ATP)2. Letzteres wurde verwendet, um die Rechenzeit zu beschleunigen.

Um das Andocken von ATP an NBS sicherzustellen, wurden Restraint-MD-Simulationen mit einem ähnlichen Ansatz wie von Wen et al.58 durchgeführt. Kurz darauf wurde eine Reihe abstandsbasierter Beschränkungen zwischen den Tryptophan-/Tyrosinresten der A-Schleife (Trp653 und Tyr1301 für NBD1 und NBD2) und der entsprechenden ATP-Purin-Einheit angewendet. Die Mg2+-ATP-NBD-Anordnung wurde durch die Anwendung von Beschränkungen zwischen Mg2+-Ionen und ATP-Phosphatgruppen sowie zwischen Mg2+-Ionen und Walker-A-Serin- und Q-Loop-Glutaminresten (nämlich Ser685 und Gln713 für NBD1 und Ser1333, Gln1374 für NBD2) aufrechterhalten. Darüber hinaus wurden ATP-Phosphateinheiten auch durch umgebende Walker-A-Reste eingeschränkt. Alle Abstände wurden mithilfe harmonischer Potentiale begrenzt, für die minimale Abstände und Kraftkonstanten in den Ergänzungstabellen 15–16 angegeben sind. Für die Thermalisierungs- und Box-Äquilibrierungsschritte wurden abstandsbasierte Beschränkungen angewendet. Sie wurden dann während der ersten 10 ns der Produktionsläufe reibungslos entfernt. Die Beschränkungen für Mg2+-Ionen wurden während der gesamten Simulation eingehalten.

Snapshots wurden alle 100 ps gespeichert. Für jedes System wurden drei Replikate durchgeführt, um den lokalen Konformationsraum besser abzutasten. Jeder Produktionslauf wurde für IF- und OF-Modelle für 2,0–2,5 μs bzw. 1,5–2,0 μs durchgeführt (Ergänzungstabelle 17). Tatsächlich erreichten mit dem OF-Modell durchgeführte Simulationen das Gleichgewicht schneller als IF-Konformationen (siehe zeitabhängige RMSDs in der ergänzenden Abbildung 40). In der vorliegenden Studie beträgt die aggregierte MD-Gesamtzeit 112,4 μs.

Simulationen wurden mit dem CPPTRAJ59-Paket und internen Python-Skripten unter Nutzung des MDAnalysis-Moduls60,61 analysiert. Diagramme wurden mit dem Python-Paket matplotlib v3.3.162 erstellt. Strukturvisualisierung und Rendering wurden mit der VMD-Software63 (v1.9.3 und Alpha-v1.9.4) erstellt. Die sogenannten ABC-Strukturparameter (d. h. IC-Winkel, EC-Winkel, NDB-Abstand, NBD-Twist und EC-Abstand) wurden unter Verwendung der gleichen Definition berechnet, die Hofmann et al.1 für IC-Winkel, EC-Winkel, EC-Abstand und NBD vorgeschlagen haben Abstand oder Moradi et al.18 für NBD-Twist. Kurz gesagt beschreibt der IC-Winkel die IC-Öffnung des Substrateintritts und wird durch den Winkel zwischen zwei Vektoren definiert; Beide beginnen am Schwerpunkt der gesamten extrazellulären Region und sind entweder auf die IC-Region von TMH1, TMH2, TMH3, TMH6, TMH10 und TMH11 oder auf die IC-Region von TMH4, TMH5, TMH7, TMH8, TMH9 und TMH12 gerichtet. Ebenso beschreibt der EC-Winkel die EC-Öffnung für die Substratfreisetzung und wird durch den Winkel zwischen zwei Vektoren definiert, die vom Massenschwerpunkt beider NBDs ausgehen und entweder auf die EC-Region von TMH1, TMH2, TMH9, TMH10, TMH11 und gerichtet sind TMH12 oder die EC-Region von TMH3, TMH4, TMH5, TMH6, TMH7 und TMH8. Der EC-Abstand wurde als Abstand zwischen den EC-Regionen von TMH1, TMH2, TMH9, TMH10, TMH11 und TMH12 und der EC-Region von TMH3, TMH4, TMH5, TMH6, TMH7 und TMH8 definiert. Der NBD-Abstand wurde als Abstand zwischen den beiden NBD-Massenschwerpunkten definiert. Da diese Definitionen auf die aktuellen MD-Modelle von bMRP1, aber auch auf verfügbare aufgelöste Strukturen anderer ABC-Transporter angewendet wurden, wurden intrazelluläre und extrazelluläre Regionen basierend auf der in der OPM-Datenbank vorgeschlagenen Membrandicke definiert42. Die Auswahl der Rückstände für jedes System und jeden Strukturparameter ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Für jedes System und jede Lipiddoppelschicht wurde die lokale freie Energielandschaft unter Verwendung des InfleCS-Ansatzes berechnet, der die Vorteile von Gaussian Mixture Models (GMM) nutzt23,64. Strukturparameter (d. h. IC- und EC-Winkel, NBD-Abstand und -Verdrehung) wurden verwendet, um die freie Energielandschaft unter Verwendung einer auf 80 eingestellten Gittergröße zu überwachen, von 2 bis 12 Gaußschen Komponenten für jedes GMM, das durch maximal 20 Iterationen erhalten wurde. Die Relevanz des InfleCS-Ansatzes hängt stark von der Qualität der Probenahme während MD-Simulationen ab. In der vorliegenden Arbeit bildet InfleCS nur die freie Energielandschaft um die lokalen Minima ab, die während unserer MD-Simulationen erfasst wurden. Darüber hinaus wurden die MD-Probenahme und die Relevanz von InfleCS für die vorliegenden Systeme sichergestellt, indem die Konvergenzprofile für jeden Strukturparameter separat berechnet wurden (Ergänzende Abbildungen 41–43).

Das Wasserporenprofil des bMRP1 TM-Hohlraums wurde mit der Hole2.2-Software65 berechnet, indem alle 10 ns Schnappschüsse gemacht wurden. Das durchschnittliche TM-Porenprofil wurde durch Mittelung des ausgeglichenen Teils der Trajektorien unter Berücksichtigung aller Replikate berechnet. Die zeitabhängige TM-Porenentwicklung von Anfang an wurde auch in ausgewählten Tiefen in der Lipiddoppelschichtmembran (z = 18, 5, –15 und –22 Å) durch Bootstrapping alle 100 ns entlang MD-Trajektorien berechnet (dh 10 Schnappschüsse × 3 Replikate jeweils 100). ns). Die Profile wurden dann gemittelt und PC P-Atom-Z-Dichteprofile wurden verwendet, um das Zentrum der Lipiddoppelschichtmembran (z = 0) zu definieren. Hinsichtlich der Neigungswinkel wurden alle Systeme auf das OF bMRP-(ATP)2-Modell abgestimmt, das in POPC:POPE:Chol (2:1:1) eingebettet ist. Lipidverteilungen wurden mit dem CPPTRAJ59-Paket erhalten. Die Lipidbelegungen wurden für jeden Polkopf (dh PE oder PC) oder das gesamte Cholesterinmolekül um das Protein herum berechnet, wobei Schwellenbelegungen von 50 oder 80 % berücksichtigt wurden. Die vom Flugblatt abhängigen Lipiddichten wurden unter Verwendung des Rasterschlüsselworts in CPPTRAJ berechnet, wobei der Schwerpunkt auf polaren Kopflipiden (PE oder PC) oder der Cholesterin-OH-Gruppe lag. Der Schwerpunkt lag nur auf der hochdichten Polkopfregion, die durch Überwachung der z-abhängigen Dichtepeaks von Phosphatatomen für PC- und PE-Lipide oder von O-Atomen für Cholesterinmoleküle erhalten wurde. Membrandicken wurden mit dem MEMBPLUGIN für VMD63,66 ermittelt. Die Verformung der freien Energie wurde durch Berechnung der Kosten der freien Energie der Membranverformung in Gegenwart von bMRP1 sowie der Referenzen der freien Energie für Flachmembranen mithilfe der CTMDapp-Software30 bewertet. Alle für diese Berechnungen verwendeten Parameter sind in der Ergänzungstabelle 18 aufgeführt. Angesichts der vorliegenden Stichprobe, der Größe des Proteins und der Relevanz der Biege- und Kompressibilitätsmodule in aktuellen Gesamtatomsimulationen werden die in Abb. 4c dargestellten Ergebnisse qualitativ diskutiert.

Hauptkomponentenanalysen wurden auch mit dem CPPTRAJ59-Paket durchgeführt, wobei der Schwerpunkt auf dem ABC-Kern lag, der durch die Rückgratatome von TMH1 bis TMH12, NBD1 und NBD2 definiert ist. Systemvariabilitäten wurden untersucht, indem für jedes System eine unabhängige PCA durchgeführt wurde, bei der jedes Replikat an einer durchschnittlichen Struktur des Systems ausgerichtet war. Netzwerkanalysen wurden mit dem VMD Network Analysis-Plugin63,67 durchgeführt. Dynamische Kreuzkorrelationsmatrizen (DCCM) wurden für jedes Replikat separat berechnet, auf dem Cα-Atome als Knoten ausgewählt wurden und alle Standardeinschränkungen (notSameResidue, notNeighboringCAlpha, notNeighboringPhosphate, notNeighboringResidue) angewendet wurden. Die Communities wurden dann mithilfe von gncommunities67 berechnet. Allosterische Netzwerkpfade wurden mithilfe des kürzlich von Westerlund et al.26,27 entwickelten Allopath-Ansatzes bestimmt. Kurz gesagt, die entfernte „Kommunikationseffizienz“ zwischen zwei Domänen wurde aus der Kontaktkarte und der gegenseitigen Informationsmatrix von Proteinresten sowie Nicht-Protein-Interaktoren wie umgebenden Lipiden und gebundenen Molekülen (z. B. Nukleotide und Substrate) ermittelt. Ein solcher Ansatz liefert auch ein Zwischenprofil, das die Beteiligung jeder Komponente (dh Rest, Lipid, Substrat und Nukleotid) abbildet. Für jedes Lipidmolekül wurden drei Knoten definiert, die der polaren Kopfgruppe und den beiden Lipidschwänzen entsprechen (ergänzende Abbildung 44). ATP wurde außerdem in drei Knoten gespalten: Purin- und Ribose-Anteil sowie Triphosphat-Schwanz. Das LTX-Substrat wurde in drei Knoten unterteilt: Glutathion-Anteil, mehrfach ungesättigter Schwanz und Hydroxypentansäure. Mg2+-Ionen und Cholesterinmoleküle wurden jeweils als ein Knoten betrachtet. Die Atomauswahl pro Knoten ist in der ergänzenden Abbildung 44 angegeben. Allosterische Pfade wurden von der Substratbindungstasche zu jedem NBS separat berechnet, wie in der ergänzenden Tabelle 9 definiert. H-Brückenanalysen (ergänzende Abbildungen 45 und 46) wurden mit CPPTRAJ59 durchgeführt wobei die Abstands- und Winkelgrenzwerte auf 3,5 Å bzw. 120° eingestellt wurden. Mit CPPTRAJ berechnete DCCM sind auch in den ergänzenden Abbildungen verfügbar. 47–50. Strukturbeschreibungen lokaler Minima wurden nur für den äquilibrierten Teil der MD-Simulationen durchgeführt, d. h. unter Berücksichtigung der letzten 800 ns, wie aus den RMSD-Profilen in der ergänzenden Abbildung 41 hervorgeht.

Für alle in diesem Artikel beschriebenen MD-Analysen wurden Daten aus n = 3 MD-Simulationen für jeden Zustand abgeleitet (d. h. IF apo bMRP1, bMRP1-LTX, bMRP1-(ATP)2, bMRP1-LTX-(ATP)2 und OF bMRP1). -(ATP)2) und Lipiddoppelschichtmembranen (d. h. reines POPC, POPC:Chol (3:1) und POPC:POPE:Chol (2:1:1) für alle Zustände, aber auch reines POPE und POPC:POPE ( 3:1) für IF apo bMRP1 und OF bMRP1-(ATP)2). Mit anderen Worten: Es wurden 19 Systeme für 57 Simulationen berücksichtigt. Die Analysen wurden systematisch durchgeführt, wobei jedes System unabhängig war. Durchschnittswerte und Standardabweichungen wurden im Allgemeinen ermittelt, indem Daten von jedem Replikat insgesamt gezogen wurden, um die Konformationsvariabilität der Probenahme anzuzeigen. Für H-Brücken-Analysen, freie Energieverformung und allosterische Kommunikation wurden die Ergebnisse für jedes Replikat separat berechnet und Durchschnitts- und Standardabweichungen sowie Fehler über die drei unabhängig behandelten Replikate ermittelt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Datensätze aus MD-Simulationen, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, sind auf begründete Anfrage bei den Autoren erhältlich. Die Quelldaten, die den in den Hauptabbildungen dargestellten Ergebnissen und Diagrammen zugrunde liegen, MD-Eingaben sowie anfängliche und endgültige Koordinatenkonfigurationen für jeden Zustand und jedes Lipidmodell sowie die Zusatzfilme 1–5 können unter dem folgenden Zenodo-Zugriffslink heruntergeladen werden: https://doi .org/10.5281/zenodo.7541178.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. Benjamin Chantemargue und Dr. Mehdi Benmameri für anregende und fruchtbare wissenschaftliche Diskussionen. Wir danken Xavier Montagutelli von der IT-Abteilung der Universität Limoges für die technische Unterstützung bezüglich Supercomputer-Einrichtungen. Die Berechnungen wurden mit den Supercomputern CALI („CAlcul en LImousin“) und „Baba Yaga“ der Universität Limoges sowie auf dem nationalen Supercomputer „Jean-Zay“ von IDRIS HPC Resources unter den Zuteilungen 2020-A0080711487 und 2021-A0100711487 durchgeführt Hergestellt von GENCI. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der „Agence Nationale de la Recherche“ (ANR-19-CE17-0020-01 IMOTEP und ANR-21-CE18-0030 RAPRACLID), der Région Nouvelle Aquitaine und des „Institut National de la Santé et de la“ unterstützt Recherche Médicale“ (INSERM, AAP-NA-2019-VICTOR).

Inserm U1248 Pharmakologie und Transplantation, ΩHealth Institute – Univ. Limoges, 2 rue du Prof. Descottes, 87000 F, Limoges, Frankreich

Ágota Tóth, Angelika Janaszkiewicz, Veronica Crespi und Florent Di Meo

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BEI. und FDM konzipierte die Studie. BEI. und FDM führte alle Simulationen durch. Á.T., AJ, VC und FDM analysierten die Simulationen. BEI. und FDM interpretierten die Ergebnisse und diskutierten sie gemeinsam mit AJ und VC Á.T. und FDM haben das Manuskript geschrieben und es wurde von allen Autoren bearbeitet, überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Florent Di Meo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Mahmoud Moradi und Shuguang Yuan für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Yun Lyna Luo und Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tóth, Á., Janaszkiewicz, A., Crespi, V. et al. Über das Zusammenspiel zwischen Lipiden und der asymmetrischen Dynamik eines NBS-degenerierten ABC-Transporters. Commun Biol 6, 149 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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Eingegangen: 20. Mai 2022

Angenommen: 25. Januar 2023

Veröffentlicht: 3. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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