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Aug 04, 2023

SARS

Band Kommunikationsbiologie

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1170 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Das trimere Spike (S)-Glykoprotein, das aus der SARS-CoV-2-Virushülle hervorsteht, bindet an menschliches ACE2, ausgelöst durch den Wechsel der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) mindestens eines Protomers von „unten“ (geschlossen) nach „oben“. " (offener) Zustand. Hier verwendeten wir groß angelegte Molekulardynamiksimulationen und zweidimensionale Replika-Austausch-Umbrella-Sampling-Berechnungen mit mehr als tausend Fenstern und einer Gesamtsimulation von 160 μs, um diesen Übergang mit und ohne Glykane zu untersuchen. Wir stellen fest, dass der glykosylierte Spike eine höhere Öffnungsbarriere aufweist und auch energetisch den Down-Zustand gegenüber dem Up-Zustand begünstigt. Die Analyse des S-Protein-Öffnungswegs zeigt, dass Glykane an N165 und N122 die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der RBD und der N-terminalen Domäne im Up-Zustand stören, während Glykane an N165 und N343 sowohl den Down- als auch den Up-Zustand stabilisieren können. Abschließend schätzen wir ab, wie sich die Epitop-Exposition für mehrere bekannte Antikörper entlang des Öffnungspfads ändert. Wir stellen fest, dass das Epitop des BD-368-2-Antikörpers kontinuierlich freigelegt ist, was seine hohe Wirksamkeit erklärt.

Die durch das Coronavirus SARS-CoV-2 verursachte COVID-19-Pandemie breitete sich schnell weltweit aus und hatte beispiellose schädliche Auswirkungen auf die globale Gesundheit und Wirtschaft1. Die schnelle Entwicklung mehrerer Impfstoffe2, Behandlungen mit monoklonalen Antikörpern3 und Therapeutika4 hat den aktuellen Virusausbruch eingedämmt. Die anhaltende Bedrohung durch Varianten, einschließlich der mittlerweile vorherrschenden Omicron-Unterlinien5, und die Möglichkeit zukünftiger Coronavirus-Ausbrüche6 erfordern jedoch ein umfassendes Verständnis des viralen Lebenszyklus, einschließlich Erkennung, Bindung, Infektion und Immunantwort.

Eine SARS-CoV-2-Infektion wird durch die Erkennung und Bindung an den Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2)-Rezeptor der Wirtszelle eingeleitet7,8. Dieser Prozess wird durch das SARS-CoV-2-Spike (S)-Protein vermittelt, ein homotrimeres Klasse-I-Fusionsglykoprotein, das aus der Oberfläche des SARS-CoV-2-Virions herausragt. Die Veröffentlichung der S-Protein-Sequenz Anfang 2020 führte in Kombination mit früheren Strukturarbeiten an verwandten Betacoronaviren zur schnellen Bestimmung der Strukturen gelöster, vor der Fusion stabilisierter S-Protein-Ektodomänenkonstrukte9,10,11 sowie Spikes voller Länge12 und intakte Virionen13. Jedes Protomer besteht aus den S1- und S2-Untereinheiten, die durch eine multibasische Furin-Spaltungsstelle getrennt sind. S1 enthält die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) und vermittelt die Erkennung der Wirtszelle, während S2 aus der Membranfusionsmaschinerie besteht, die für den Viruseintritt erforderlich ist7. Das S-Protein ist ein wichtiges Antigenziel mit mehreren Epitopen, auf die das menschliche Immunsystem abzielt, einschließlich der RBD und der N-terminalen Domäne (NTD)14,15,16,17. Es wird auch angenommen, dass rekombinantes RBD ein potenzieller Eintrittshemmer gegen SARS-CoV-218 ist. Darüber hinaus trägt die Glykosylierung des S-Proteins dazu bei, das Virus zu maskieren und vor der Reaktion des Immunsystems des Wirts zu schützen19,20,21. Das S-Protein ist durch absteigende und aufsteigende Konformationszustände gekennzeichnet, die sich vorübergehend über eine scharnierartige Bewegung ineinander umwandeln und dabei das Rezeptorbindungsmotiv (RBM) freilegen, das aus den RBD-Resten S438 bis Q50622 besteht. Das RBM ist in der Interprotomer-Schnittstelle des Down-S-Proteins vergraben; Daher beruht die Bindung an ACE2 auf der stochastischen gegenseitigen Umwandlung zwischen den Down- und Up-Zuständen.

Kryo-Elektronenmikroskopie-Studien (Kryo-EM) haben detaillierte Strukturinformationen sowohl für den Aufwärts- als auch für den Abwärts-Konformationszustand ergeben23. Allerdings haben relativ wenige Studien die Dynamik dieser Auf-/Ab-Zustände und die gegenseitige Umwandlung zwischen ihnen untersucht. Beispielsweise wurde Einzelmolekül-FRET verwendet, um die stochastische Natur der S-Protein-Übergänge24 zu demonstrieren, wobei Zeitskalen in der Größenordnung von Millisekunden bis Sekunden angegeben wurden. Bemerkenswert ist, dass spätere Einzelmolekül-FRET-Studien eine veränderte Down-Up-Übergangskinetik für mutierte Spike-Proteine ​​fanden25. Simulationen der Molekulardynamik (MD) ergänzen diese experimentellen Studien, indem sie die Beschreibungen der Zwischenzustände zwischen Down und Up auf atomarer Ebene liefern, die zur Charakterisierung der S-Protein-Öffnungsdynamik erforderlich sind. MD-Simulationen haben detaillierte Informationen über die strukturelle Stabilität und die Rolle der Glykosylierung sowohl für den Down- als auch den Up-Zustand sowie über Wechselwirkungen zwischen Resten und Einzelheiten der Bindung an ACE220,21,26,27,28,29 ergeben. Es wurde über Öffnungswege berichtet, die mithilfe von gesteuerter MD und gezielter MD bestimmt wurden29,30,31. Darüber hinaus haben umfangreiche Simulationen unter Verwendung verbesserter Stichprobentechniken wie gewichtetes Ensemble32 und adaptives Sampling mit Fluktuationsverstärkung spezifischer Merkmale (FAST) in Kombination mit Folding@home33 Details zu mehreren Wegen für die S-Protein-Öffnung geliefert. Darüber hinaus zeichnen sich allmählich Merkmale der Energielandschaft dieser Konformationsübergänge ab, die für die Bindung und den Eintritt von Viren notwendig sind27,30,31,34, einschließlich der Kombination von Kryo-EM-Daten mit MD-Simulationen, um mehrere Subpopulationen für beide zu offenbaren Abwärts- und Aufwärtszustände35,36.

Eine aktuelle Studie von Amaro und Mitarbeitern hat die funktionelle Rolle von Glykanen an N165 und N234 über die Abschirmung26 hinaus hervorgehoben, basierend auf separaten Gleichgewichtssimulationen der S-Protein-Down- und Up-Zustände. Wenn das RBD in den Up-Zustand übergeht, rotiert das Glykan an N234 in den entstehenden Hohlraum und stabilisiert so die Up-Konformation. Darüber hinaus haben MD-Simulationen und Mutagenese Beiträge des Glykans an N343 zur Dynamik der RBD-Öffnung und der ACE2-Bindung gezeigt32. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Glykan an N343 eine Rolle beim öffnenden Konformationsübergang durch „Anheben“ des RBD durch sequentielle Wechselwirkungen mit mehreren RBD-Resten spielt, was als „Glykan-Gating“ bezeichnet wird.

Hier beschreiben wir neu bestimmte zweidimensionale (2D) freie Energielandschaften der Öffnungs- und Schließübergänge des SARS-CoV-2-S-Proteins mithilfe von REUS-Simulationen (Replica Exchange Umbrella Sampling), die auf dem Prä-Exascale-Supercomputer Summit in Oak Ridge durchgeführt wurden National Lab (ORNL) für glykosyliertes und nicht glykosyliertes S-Protein. Wir beleuchten den Einfluss von Glykanen auf jeden Zustand und auf die Kinetik der Spike-Öffnung. Darüber hinaus analysierten wir die Freilegung prominenter Epitope auf der S-Protein-Oberfläche und lieferten ein dynamisches Bild der Antikörperbindung entlang des Spike-Öffnungspfades. Abschließend berichten wir über die Ergebnisse von Gleichgewichts-MD-Simulationen der glykosylierten und nicht glykosylierten Systeme für den Down- und Up-Konformationszustand, um die stabilisierende Rolle der Glykane weiter zu charakterisieren.

Mithilfe von REUS-Simulationen haben wir die Änderung der freien Energie vom unteren Zustand des Spikes in den oberen Zustand sowohl bei vollständiger Glykosylierung als auch bei nicht-glykosyliertem Zustand untersucht. Wir haben den Up-Zustand des Wildtyps (WT) basierend auf der Diprolin-Mutantenstruktur von Walls et al.10 (PDB: 6VYB) modelliert. Der Down-Zustand wurde unter Verwendung einer neueren Struktur von Cai et al.12 (PDB: 6XR8) ohne die Diprolin-Mutationen modelliert. Das Glykan mit der höchsten Population in den Massenspektroskopiedaten von Crispin und Mitarbeitern19 an jedem Standort wurde mithilfe des GLYCAM-Webservers hinzugefügt, der von der Woods-Gruppe entwickelt wurde (http://glycam.org)37,38. Diese Modelle sind in Abb. 1a, b dargestellt, mit zusätzlichen Details zu den Systemen unter Methoden.

a Das trimere S-Protein im All-Down-Zustand, gefärbt durch Protomer. Glykane werden als rote Kugeln dargestellt. b Draufsicht auf das S-Protein im One-up-Zustand. Wichtige Domänen des Spikes werden hervorgehoben, darunter die N-terminale Domäne (NTD, 14–306), die Rezeptorbindungsdomänen (RBD, 336–518), die Heptad-Wiederholung 1 (HR1, 908–986) und die zentrale Helix (CH, 987–1035). c, d Zu den beiden kollektiven Variablen, die zur Beschreibung der Öffnung von RBD-A definiert sind, gehören: c der Schwerpunktabstand d zwischen RBD-A (336–518, rosa) und SD1-B (531–592, Limette), und d der Diederwinkel ϕ, der durch den Massenschwerpunkt der Domänen RBD-A (336–518, rosa), SD1-A (531–592, lila), SD2-A (593–677, eisblau) und gebildet wird NTD-A (27–307, Cyan). RBD-A wird sowohl im unteren (durchgehend rosa) als auch im oberen (transparent rosa) Zustand angezeigt.

Wir führten zunächst Metadynamiksimulationen der Kryo-EM-Strukturen im Down- und Up-Zustand durch, um ihnen die Erkundung des Konformationsraums um sie herum und die Verbindung der beiden Strukturen zu ermöglichen. Der Konformationsraum wird durch zwei kollektive Variablen beschrieben, nämlich (1) den Schwerpunktabstand (d) zwischen der Öffnung RBD-A und einem stationären Teil des Spikes, der als Drehpunkt fungiert, nämlich der benachbarten Subdomäne 2 Kette B (SD2-B) und (2) der Diederwinkel (ϕ), der durch die Massenschwerpunkte des öffnenden RBD-A und anderer stationärer Domänen auf demselben Protomer, nämlich SD2-A, SD1-A und NTD-, gebildet wird. A (Abb. 1c, d). Es wurde bestätigt, dass die stationären Domänen im Vergleich zum Bewegungsbereich von RBD-A eine minimale Dynamik aufweisen (Tabelle S1). Anschließend wurden Schnappschüsse aus den Metadynamiksimulationen extrahiert, um die REUS-Simulationen zu starten, die mit denselben beiden kollektiven Variablen durchgeführt wurden. Für das glykosylierte System führten wir außerdem ein simuliertes Annealing der Glykane durch, um ihre Konformationen in jedem Fenster zu randomisieren. Eine Reihe von REUS-Simulationen wurde durchgeführt, um verschiedene Bereiche des d-ϕ-Raums weiter zu untersuchen, wobei bis zu 1049 und 1211 Fenster (Tabelle S2) und eine Gesamtsimulationszeit von 65 μs und 91 μs für die glykosylierten und nicht glykosylierten Systeme verwendet wurden , jeweils.

Für das glykosylierte System stellten sich die Konformationen der beiden Kryo-EM-Strukturen wie erwartet als Energieminima auf dem 2D-Potential der mittleren Kraft (PMF) dar (Abb. 2a). Zwischen den beiden stabilen Konformationen besitzt der Up-Zustand eine um 5,2 ± 0,1 kcal/mol höhere Energie als der Down-Zustand (Abb. 2c, S1a). Dieser Befund steht im Einklang mit mehreren rechnerischen Studien unter Verwendung verschiedener verbesserter Stichprobenmethoden, die auch zu dem Schluss kamen, dass der Down-Zustand die wahrscheinlichere Konformation ist33,34,39,40. Die Unterschiede zwischen den beiden Energiequellen im Endzustand beschränken sich nicht nur auf ihre Tiefe, sondern auch auf ihre Breite. Wenn wir die Breite der Energiequellen entlang d bei 2,5 kcal/mol über ihren Energieminima messen, erstreckt sich die Energiequelle im unteren Zustand von d = 43,1 Å bis 48,9 Å, während die Energiequelle im oberen Zustand d = 60,1 Å bis abdeckt 75,6 Å, wodurch letzteres 2,7-mal so breit ist wie ersteres. Jüngste Arbeiten von Zimmerman et al.33 und Sztain et al.32 kommen außerdem zu dem Schluss, dass die RBD im Up-State sehr flexibel ist und eine breite Palette von Up-State-Strukturen ermöglicht, die sich weiter öffnen als die Kryo-EM-Struktur. Mit unserem PMF lässt sich nun abschätzen, wie wahrscheinlich es ist, solch weit offene Strukturen zu beobachten. Wir haben auch den minimalen Energiepfad (MEP)41,42 berechnet, der die Abwärts- und Aufwärtszustände verbindet (Abb. 2a, Zusatzfilm 1). Der Pfad ist auf dem 2D-PMF größtenteils diagonal, mit Ausnahme eines starken Anstiegs von ϕ beim Verlassen der Energiequelle im unteren Zustand und einer leichten Abnahme von ϕ beim Eintritt in die Energiequelle im oberen Zustand. Die Energiebarriere, die die beiden stabilen Konformationen trennt, hat eine Höhe von 11,0 ± 0,1 kcal/mol und liegt bei d = 55,6 Å.

a, b Die 2D-PMFs der a glykosylierten und b nicht glykosylierten Systeme entlang zweier kollektiver Variablen, d und ϕ, die zur Beschreibung der Öffnung von RBD-A definiert sind (Abb. 1c, d). Die Lage der Kryo-EM-Strukturen im Down- (6XR8) und Up-State (6VYB) ist mit einem „+“- bzw. „x“-Zeichen gekennzeichnet. Die schwarz gepunktete Linie zeigt den MEP für jedes System. c Die freien Energien werden auf d projiziert und als 1D-PMFs dargestellt. Siehe auch Ergänzende Daten 1.

Der PMF für das nicht glykosylierte System ist qualitativ ähnlich, unterscheidet sich jedoch quantitativ deutlich vom glykosylierten (Abb. 2b). Ohne die Glykane wird der Energieunterschied zwischen dem Down- und Up-Zustand überraschend klein und fällt unter den statistischen Fehler (Abb. 2c, S1b). Das Breitenverhältnis entlang d zwischen den Energiequellen im unteren und oberen Zustand bleibt bei 2,7, genau wie beim glykosylierten System, wobei sich die Quelle im unteren Zustand von d = 43,6 Å bis 49,1 Å erstreckt und die Quelle im oberen Zustand von d = 59,0 Å bis 74,1 Å. Die viel breitere Energiequelle im oberen Zustand führt trotz der geringen Energiedifferenz zwischen ihnen zu einer dominierenden Gleichgewichtspopulation von 88 % gegenüber der Population im unteren Zustand von 12 %. Sowohl die Position des Energieminimums im oberen Zustand als auch die Energiebarriere verschieben sich in Richtung des unteren Zustands und bewegen sich von d = 70,6 Å auf 67,6 Å bzw. von d = 55,6 Å auf 52,6 Å. Wir stellen außerdem fest, dass die Höhe der Energiebarriere zwischen den beiden stabilen Konformationen auf 5,1 ± 0,1 kcal/mol reduziert ist. Wenn wir die obigen Informationen kombinieren, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Entfernung von Glykanen nicht nur das Bevölkerungsverhältnis zwischen unten und oben im Bundesstaat umkehrt, sondern auch das Ausmaß der RBD-Öffnung im Minimum im oberen Bundesstaat beeinflusst, was möglicherweise die Funktionalität des S. beeinträchtigt Eiweiß. Experimente haben auch gezeigt, dass die Entfernung von Glykanen um die RBD (N234, N165 und N343)26,32 oder die Verringerung der Glykankomplexität43 zu einer Verringerung der ACE2-Bindung führt.

Um die Kinetik der S-Protein-Öffnung zu quantifizieren, haben wir die mittlere erste Durchgangszeit (MFPT) entlang des MEP unter Verwendung der Smoluchowski-Diffusionsgleichung für das glykosylierte System berechnet (siehe Ergänzende Anmerkung 1)44,45. Die Smoluchowski-Diffusionsgleichung liefert eine einfache Beschreibung eines Brownschen „Teilchens“, die sich nur auf den Diffusionskoeffizienten und die freie Energie entlang des MEP stützt. Zusätzliche eingeschränkte Simulationen wurden durchgeführt, um den Diffusionskoeffizienten entlang des MEP mithilfe der Geschwindigkeitsautokorrelationsfunktion (VACF)46,47 zu bestimmen. Die MFPT vom Aus-Zustand in den Auf-Zustand beträgt 1478,5 ms, während der umgekehrte Zustand 0,9 ms beträgt. Im Vergleich mit der experimentellen Beobachtung durch Einzelmolekül-FRET24 scheint es, dass der MFPT von unten nach oben um etwa das Fünffache überschätzt und für die umgekehrte Richtung um etwa das Hundertfache unterschätzt wird, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass wir ihn nicht berücksichtigt haben für die lange Zeitspanne, die Glykane benötigen, um sich bei der Berechnung des Diffusionskoeffizienten auszugleichen. Wir haben auch den MFPT für das nicht glykosylierte System angenähert. Die verringerte Übergangsbarriere im PMF (Abb. 2c) führte zu einer gleichzeitigen Verringerung des MFPT, der 143 μs für den Übergang von unten nach oben und 497 μs für den Übergang von oben nach unten beträgt.

Als nächstes betrachteten wir die chemische Dynamik gemäß den folgenden gepaarten Reaktionen:

wobei D den unteren Zustand des S-Proteins darstellt, U den oberen Zustand und U:ACE2 den gebundenen Zustand (Abb. 3a). Die Öffnungs-/Schließungsraten (kopen/kclose) werden durch die MFPTs bestimmt und die Bindungs-/Entbindungsraten (kon/koff) für RBD allein an ACE2 werden von Lan et al.22 übernommen. Nachdem wir die Master-Gleichung für diese Reaktionen gelöst haben ([ACE2]i = 15 nM; siehe Ergänzende Anmerkung 1), stellen wir fest, dass die Populationen für das nicht glykosylierte S-Protein zu 70 % gebunden, zu 23 % hoch, aber ungebunden sind nur 7 % gesunken (Abb. 3b). Eine gründliche Mutationsuntersuchung des RBD ergab, dass jede Mutation zu N343, die das an dieser Position gebundene Glykan eliminiert, der Bindung abträglich ist, mit einem abgeleiteten ΔΔG von +0,35 bis 2,03 kcal/mol48. Wenn wir unsere ungefähren Öffnungs-/Schließraten für das nicht glykosylierte S-Protein verwenden, aber die Bindungs-/Entbindungsraten entsprechend den Mutationsdaten modifizieren, stellen wir fest, dass die Population des gebundenen Zustands auf 8 % abnimmt (ΔΔG = 2,03 kcal/mol; Abb. 3d) und 57 % (ΔΔG = 0,35 kcal/mol; Abb. 3c). Obwohl die Entfernung aller Glykane die Begünstigung des Up-Zustands erhöht, könnte eine damit verbundene Verringerung der Bindungsaffinität den ansonsten erwarteten Gewinn in der ACE2-gebundenen Population zunichte machen (Abb. 3e).

a Übergänge zwischen RBD-Abwärts-, Aufwärts- und gebundenen Zuständen werden mit den zugehörigen Raten angezeigt. b–d Anteil der S-Proteine ​​in jedem Zustand (oben, unten und ACE2-gebunden) unter verschiedenen Bedingungen, nämlich b ohne Glykane, c ohne Glykane und einem angenommenen Anstieg der freien Energie der Bindung von RBD an ACE2 von 0,35 kcal/mol und d ohne Glykane und einem Anstieg der freien Bindungsenergie um 2,03 kcal/mol. e Anteil des gebundenen Zustands im Gleichgewicht für die drei Bedingungen in (b–d).

Um die Auswirkungen von Glykanen auf die Energetik der Spike-Öffnung besser zu charakterisieren, haben wir untersucht, wie das RBD mit dem Rest des Proteins interagiert, wenn in den REUS-Simulationen Glykane vorhanden sind oder nicht. Wir haben die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem sich öffnenden RBD-A und dem Rest des Proteins berechnet und sie entlang des Pfadparameters aufgetragen (Abb. 4a, b, S2). Wir fanden heraus, dass diese Zahl im Allgemeinen abnimmt, wenn sich RBD-A öffnet, wobei die Wechselwirkungen nach dem Überschreiten der Energiebarriere deutlich zunehmen, und zwar stärker mit Glykanen als ohne. Die Gesamtzahl der mit RBD-A gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen ist für das glykosylierte System höher, insbesondere im Down-Zustand. Wenn wir jedoch nur Protein-Protein-Wasserstoffbrücken berücksichtigen, konnte das nicht glykosylierte RBD-A mehr Verbindungen mit den anderen Proteindomänen eingehen. Der insgesamt rückläufige Trend bei den Interaktionen erklärt sich aus der Tatsache, dass sich RBD-A beim Öffnen vom Rest des Proteins entfernt und folglich den Kontakt zum Rest des trimeren S-Proteins, einschließlich benachbarter RBDs und S2-Domänen, unterbricht. Diese Bewegung allein reicht jedoch nicht aus, um die Zunahme der Wechselwirkungen nach dem Überschreiten der Energiebarriere sowie die anderen Unterschiede zwischen glykosylierten und nicht glykosylierten Simulationen zu erklären.

a, b Entlang der MEPs, wie durch den Pfadparameter λ angezeigt (siehe Abb. S2), wird die Anzahl der zwischen der Öffnung RBD-A und dem Rest der Spitze gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen gezählt und nach Domänen für a glykosyliert und klassifiziert b nicht glykosylierte Systeme. Die Standorte der Energiequellen im Unter- und Oberland werden mit weißem Hintergrund angezeigt, während andere Regionen grau schattiert sind. c, d Die durchschnittliche Anzahl der Kontakte für das glykosylierte System, die zwischen den Glykanen an c N122 und d N165 und dem benachbarten β-Strang von NTD-B (165–172) und RBD-A (353–360) gebildet werden, was andernfalls der Fall wäre bilden untereinander Wasserstoffbrückenbindungen, wenn sie nicht durch die Glykane getrennt sind. e Schnappschuss aus der REUS-Simulation, der zeigt, wie die Glykane an N165 und N122 die Bildung von Wasserstoffbrücken zwischen RBD-A und NTD-B stören und den oberen Zustand im Vergleich zum nicht glykosylierten System destabilisieren.

Ein genauerer Blick auf die Veränderungen der Wasserstoffbrückenbindungszusammensetzung entlang des MEP verrät mehr über die Rolle der Glykane beim Zustandsübergang von unten nach oben. Während RBD-A einen Großteil seiner Wasserstoffbrückenbindungen mit den anderen beiden RBDs und der HR1/CH-Helix der S2-Einheit bildet, wenn es sich im heruntergefahrenen Zustand befindet, ändert es sich drastisch und interagiert nur noch mit den benachbarten NTD-B und RBD-C im oberen Zustand (Abb. 4a, b, S3). Während dieses Übergangs mangelt es an stabilisierenden Wasserstoffbrückenbindungen, was zur Energiebarriere beiträgt, wie in den PMFs zu sehen ist. Durch den Einschluss der Glykane bilden diese zusätzliche Wechselwirkungen zur Stabilisierung des Proteins aus, konkurrieren aber auch mit den oben genannten Protein-Protein-Wechselwirkungen. In einer kompakten Down-State-Struktur sind die vorhandenen Protein-Protein-Wasserstoffbrückenbindungen vor der Einwirkung von Glykanen geschützt, sodass die Glykane neue Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche eingehen können, was insgesamt zu einem Anstieg der Anzahl der mit RBD-A gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen führt im Vergleich zum nicht glykosylierten System. Dieser Schutz erfolgt jedoch nicht im aktiven Zustand. Wenn RBD-A aktiv und freigelegt ist, sind seine Interaktionen mit NTD-B begrenzt. Insbesondere werden die meisten Wasserstoffbrückenbindungen zwischen RBD-A und NTD-B durch Wechselwirkungen mit den Glykanen bei N165 und N122 verdrängt, sobald RBD-A so hoch angehoben wird, dass sie dazwischen interkalieren können (Abb. 4c-e). Dadurch begünstigen die Glykane indirekt den Down-Zustand und tragen so zur höheren freien Energie des Up-Zustands für das glykosylierte System bei.

Die Ausweitung unserer Wasserstoffbrückenbindungsanalyse über das MEP hinaus und auf den gesamten kollektiven 2D-Variablenraum fördert unser Verständnis der Unterschiede zwischen den freien Energielandschaften aus den REUS-Simulationen mit und ohne Glykane. Wir haben die durchschnittliche Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem sich öffnenden RBD-A und seinem benachbarten NTD-B als Funktion der beiden kollektiven Variablen d und ϕ aufgetragen, was zeigt, dass die Zunahme der Wechselwirkungen zwischen RBD-A und NTD-B nicht auf diese beschränkt ist Zustände entlang des MEP, umfasst aber auch einen großen Bereich auf der + d-Seite der Energiebarriere (Abb. S4a). Interessanterweise erreicht die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen RBD-A und NTD-B ihren Höhepunkt bei ϕ = 40∘ und nimmt langsam ab, wenn ϕ zunimmt. Dies spiegelt das vorherige Ergebnis wider, dass Glykane eingreifen und blockieren, wenn RBD-A sich weiter von NTD-B entfernt Wechselwirkungen zwischen den beiden Domänen. Auf der − d-Seite der Energiebarriere geschieht das Gegenteil für die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen RBD-A und RBD-C, wo RBD-A und RBD-C bei großem ϕ am nächsten beieinander liegen und daher die höchste Zahl aufweisen von Wasserstoffbrückenbindungen (Abb. S4b). Diese Beobachtung erklärt den Knick des MEP beim Überschreiten der Energiebarriere für das glykosylierte System. Um die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen zu maximieren, die RBD-A stabilisieren, verlässt die Spitze die Energiequelle im unteren Zustand mit einem großen ϕ, um den maximalen Kontakt zwischen RBD-A und RBD-C aufrechtzuerhalten, bevor sie beim Eintritt abrupt auf ein kleineres ϕ umschaltet Energiequelle im Up-State, um den Kontakt mit NTD-B zu maximieren.

Um die Langzeitdynamik der Glykane zu beurteilen, führten wir zwei 2-μs-Gleichgewichtssimulationen sowohl des glykosylierten als auch des nicht-glykosylierten Systems durch. Bei der Projektion auf die beiden in REUS verwendeten kollektiven Variablen blieben alle drei Protomere im Down-Zustand für beide Replikate in der Down-Konformation, sowohl mit als auch ohne Glykane (Abb. S5). Obwohl während der Gleichgewichtssimulationen kein Übergang zwischen den Aufwärts- und Abwärtszuständen stattfand, weisen die Aufwärtszustände sowohl für das glykosylierte als auch für das nichtglykosylierte System eine viel höhere Flexibilität auf als die Abwärtszustände, was den gefundenen Größenunterschied zwischen den beiden Energiequellen widerspiegelt aus den REUS-Simulationen. Interessanterweise zeigt das nicht glykosylierte RBD-A eine Tendenz, sich vom Energieminimum im oberen Zustand entlang des MEP in Richtung − d zu bewegen, während das nicht glykosylierte RBD-A ohne offensichtliche Richtungsabweichung um das Energieminimum im oberen Zustand herum tastet. Dieses Ergebnis stimmt wiederum mit den REUS-Simulationen überein, die zeigen, dass die Energiequelle im oberen Zustand für das glykosylierte System einen geringeren Gradienten zur Energiebarriere hin aufweist als von ihr weg, während die Energiequelle für das nicht glykosylierte System symmetrischer ist (Abb. 2c).

Wir analysierten auch die Wechselwirkungen von Glykanen um RBD-A, nämlich die an N165, N234 und N343 der benachbarten Kette B, unter Verwendung der Gleichgewichtssimulationen sowie der REUS-Trajektorien entlang des MEP. Kürzlich führten Amaro und Mitarbeiter atomare MD-Simulationen und Mutationsexperimente durch, um die einzelnen Rollen der oben genannten Glykane bei der Spike-Öffnung zu untersuchen26,32. In Übereinstimmung mit ihren Ergebnissen beobachteten wir die Bewegung des Glykans bei N234 von außen nach innen während des Öffnens der Spitze sowie den Glykan-Gating-Effekt durch das Glykan bei N343 (Zusatzfilm 2).

Unsere Simulationen zeigen auch, dass die Glykane an N165 und N343 eine Rolle bei der Stabilisierung sowohl des Aufwärts- als auch des Abwärtszustands spielen. Insbesondere wenn sich RBD-A im heruntergefahrenen Zustand befindet, wickeln sich Glykane an N165 und N343 um das RBM (Abb. 5a) und halten es im heruntergefahrenen Zustand. Eine ähnliche Wechselwirkung wurde in einer anderen Studie beobachtet, als ein Glykan bei N370 künstlich eingeführt wurde; es schlang sich wie ein „Schnürsenkel“21 ​​um das heruntergekommene RBD. Bemerkenswerterweise stabilisiert das Glykan an N165 auch die obere RBD, indem es einen Teil der freiliegenden RBM unterstützt (Abb. 5b). Der Kontakt zwischen den Glykanen zwischen den Glykanen an N343 und N165 ist im oberen Zustand deutlich höher als im unteren Zustand (Abb. S6), was darauf hindeutet, dass das Glykan an N343 den oberen Zustand indirekt stabilisiert, indem es mit dem Glykan an N165 interagiert (Abb. 5b). Die beiden Glykane verhindern auch, dass sich das flexible RBM an das benachbarte RBD im unteren Zustand bindet und für ACE2 unzugänglich wird, wie in einer unserer Gleichgewichtssimulationen des nicht glykosylierten Systems beobachtet (Abb. S7).

Repräsentative Positionen von S-Protein-Glykanen bei N165, N234 und N343 in den S-Protein-a-Down- und -b-Up-Zuständen, extrahiert aus den REUS-Trajektorien. c Oberflächendarstellung von RBD-Resten in (oben) Down- und (unten) Up-Zuständen, die bei N165 (grün) und N343 (orange) mit Glykanen in Kontakt kommen. Das Kreuzschraffurmuster weist auf Kontakte mit beiden Glykanen hin. Die Auf- und Ab-Zustände des S-Proteins wurden aus dem MEP ausgewählt.

Die obigen Beobachtungen werden durch die Kontaktanalyse der REUS-Trajektorien entlang des MEP bestätigt. Die Glykane bei N165 und N343 interagieren beide mit dem RBM im heruntergefahrenen Zustand, wie durch die durchschnittlichen Kontaktwerte zwischen RBD-A und Glykanen bei N165 und N343 veranschaulicht (Abb. S8, S9). Wenn sich die Spitze öffnet, schaltet das Glykan bei N165 um, um mit RBD-A-Resten unterhalb des RBM zu interagieren, während das Glykan bei N343 kaum mit RBD-A in Kontakt kommt, nachdem das System die Aktivierungsbarriere der Öffnung überquert hat (Abb. 5c). Die Kontaktanalyse für den Down-Zustand erfasst auch die RBM-Reste (F456, R457, Y489 und F490), die am Glykan-Gating beteiligt sind, wie zuvor von Sztain et al.32 berichtet.

S-Protein-Kryo-EM-Strukturen umfassen häufig eine doppelte Prolinmutation, K986P/V987P, die sich in der Schleife zwischen HR1 und CH befindet. Frühere Studien zu SARS-CoV und MERS-CoV sowie anderen Klasse-I-Fusionsproteinen haben gezeigt, dass das Vorhandensein dieses Prolinpaars in der HR1-CH-Schleife die Spike-Struktur vor der Fusion stabilisiert und die Proteinexpression erhöht – beides wichtige Aspekte des Impfstoffs Design49. Die S-Protein-Struktur von Cai et al.12 behält die WT-K986/V987-Sequenz bei und nicht die doppelten Prolinmutationen, die üblicherweise bei der Produktion stabilisierter Präfusions-Spike-Proteine ​​auftreten; Sie berichten von einer Verschiebung der S1-Untereinheiten nach innen (und damit einer engeren Packung) im Vergleich zu den früher solubilisierten Ektodomänenstrukturen12. Tatsächlich wurde der Verlust einer mutmaßlichen Salzbrücke zwischen K986 und einer Asparaginsäure (D427/D428) auf einem benachbarten Protomer mit der Entstehung der weniger dicht gepackten Strukturen in den solubilisierten Mutantenkonstrukten in Verbindung gebracht12. Gobeil et al.11 berichten, dass für das D614-S-Protein-Konstrukt mit entfernter Furinstelle das Vorhandensein der Proline Strukturen, ACE2-Bindung, thermische Stabilität und Antikörperbindung erzeugt, die dem WT-K986/V987-Paar bemerkenswert ähnlich sind. In unseren Gleichgewichtssimulationen hat diese Salzbrücke eine Belegung von etwa 30 %, gemittelt über alle drei Protomere in den beiden unabhängigen Trajektorien. Die Verringerung der oben genannten Salzbrückenbelegung ist auf die Konkurrenz mit intraprotomerischen Salzbrücken zwischen K986 und den nahegelegenen sauren Resten E748, E990 und D985 zurückzuführen, die im Bereich von ~15–25 % vorhanden sind, was auf eine vorübergehende Wechselwirkung zwischen K986 und den RBD-Asparaginsäuren hindeutet ( D427/D428). Diese konkurrierenden Wechselwirkungen sind in Abb. S10 dargestellt.

Wir haben die REUS-Simulation mit der Diprolin-Mutation für das nicht glykosylierte System wiederholt. Der resultierende PMF weist einen bescheidenen Energieunterschied zwischen dem Abwärts- und dem Aufwärts-RBD-Zustand auf, der den Aufwärtszustand begünstigt (Abb. S11), ähnlich dem, der im WT-PMF (Abb. 2b) für diese angestammten D614-Konstrukte zu sehen ist. Die Ähnlichkeit zwischen den Energiequellen im unteren und oberen Zustand im Vergleich zu denen für WT (Abb. 2b) legt nahe, dass die Diprolin-Mutation in diesen nicht glykosylierten Systemen nur eine geringfügige Störung ihrer relativen Populationen hervorruft. Im Gegensatz zu den Minima ist bei der Diprolin-Mutante ein Anstieg der Barriere zu beobachten, was auf eine Modulation der Öffnungskinetik schließen lässt. Angesichts der vorübergehenden Natur der K986-Salzbrücken und der ähnlichen relativen Energien der Abwärts-/Aufwärts-RBD-Zustände dürfte ein zusätzlicher Einfluss der Prolinmutationen ihre Tendenz sein, α-Helices zu brechen und zu verzerren. Die HR1-CH-Kurvenregion erfährt beim Übergang vom Zustand vor der Fusion zum Zustand nach der Fusion eine große Konformationsänderung und bildet eine ausgedehnte α-Helix12. Das Vorhandensein der Proline, Reste, von denen bekannt ist, dass sie α-Helices brechen/knicken, hemmt die Bildung der langen α-Helix, die für die Postfusionskonformation charakteristisch ist49. Bemerkenswert ist, dass aktuelle Simulationen von Wang et al.50, die den Übergang vom Zustand vor der Fusion zum Zustand nach der Fusion untersuchten, gezeigt haben, dass die WT-Sequenz bei 986/987 zwar dazu neigt, helikal zu werden, der Ersatz durch Proline jedoch die Bildung dieser sekundären Phase stört Struktur.

Derzeit wurden fast zehntausend neutralisierende Antikörper entdeckt, die auf das S-Protein von SARS-CoV-2 abzielen. Das bekannteste Ziel ist das S-Protein RBD51,52, obwohl einige auf NTD und andere Nicht-RBD-Epitope abzielen53. Laut der kontinuierlich aktualisierten CoV-AbDab-Datenbank54 zielen insgesamt 9906 (und wachsende) neutralisierende Antikörper auf das S-Protein, während nur 3955 auf Nicht-RBD-Epitope abzielen. Ein Vorteil des Targetings von Nicht-RBD-Epitopen auf dem S-Protein besteht darin, dass sie auch dann erkannt werden können, wenn sich das RBD in einer Down-Konformation befindet20,55. Im Gegensatz dazu kann die RBD aufgrund der starken Glykanabdeckung von RBD in der Abwärts-Konformation nur in der Aufwärts-Konformation identifiziert werden26.

Um die Auswirkung der Spike-Öffnungsdynamik auf die Epitopexposition zu verstehen, haben wir die zugängliche Oberfläche einer Reihe von Epitopen entlang des anhand von REUS identifizierten MEP berechnet. Wir haben sieben verschiedene Antikörper ausgewählt16,17,56,57,58,59,60 mit Epitopen, die mehrere Regionen auf RBD-A (einschließlich kryptischer Epitope) und NTD-B des S-Proteins umfassen. Einzelheiten zu diesen Antikörpern finden Sie in Tabelle S3. Wir führten separate Berechnungen der zugänglichen Antikörperoberfläche (AbASA) durch, einschließlich und Ausschluss der Glykane, wobei wir den gleichen Probenahmeansatz mit einer 7-Å-Sonde verwendeten. In früheren Studien wurden eine ähnliche Sondengröße20 sowie eine kleinere33 verwendet. Während diese moderate Sondengröße (7 Å) einige Spalten leicht freiliegend erscheinen lässt20, ist sie optimal für kryptische Epitope33.

Im Allgemeinen bleibt die AbASA entweder gleich oder steigt deutlich an, wenn RBD-A in den Up-Zustand übergeht. Das Epitop des STE90-C1159-Antikörpers weist während des Übergangs von unten nach oben einen Sprung in AbASA auf. Der CR3022-Antikörper bindet an ein kryptisches Epitop57, das im unteren Zustand vollständig bedeckt ist und im oberen Zustand nur geringfügig freigelegt ist. Proteinreste bedecken dieses Epitop in ähnlicher Weise über den gesamten Spike-Öffnungsweg für MEPs mit und ohne Glykane (Abb. S12). Bemerkenswerterweise ändert sich die AbASA des 2-4-Antikörpers während des Übergangs der RBD von unten nach oben nicht, obwohl sich das Epitop in der RBM befindet (Abb. 6a). Daher kommen wir zu dem Schluss, dass das gesamte RBM auch im aktiven Zustand nicht freigelegt wird. Das AbASA für das Epitop des 4A8-Antikörpers ändert sich während der Spike-Öffnung nicht wesentlich, da sich sein Epitop im N-Terminus17 befindet, der keine Konformationsänderungen erfuhr. Die AbASA des S2M11-Epitops ändert sich entlang des Spike-Öffnungspfades nicht. Darüber hinaus befindet sich ein Teil des S2M11-Epitops auf der RBD des benachbarten Protomers, das sich in unseren Simulationen nicht öffnet. Das Epitop des S2M11-Antikörpers60 überlappt leicht mit der RBD eines Protomers (Reste 440, 441 und 444), während der Großteil mit der Bindungsstelle des ACE2-Glykans an N322 auf der RBD übereinstimmt (Reste 369, 371 bis 374 und). 440)61. Überraschenderweise wird das Epitop des S309-Antikörpers58 im Up-Zustand weniger exponiert, ohne dass die Bedeckung durch die Glykane zunimmt (Abb. 6b), was darauf hindeutet, dass ein Teil des RBD (Tabelle S3) im Up-Zustand im Vergleich zu ebenfalls weniger exponiert wird der Down-Zustand.

a Freiliegender Bereich auf Antikörperepitopen (AbASA) in Gegenwart von Proteinen und Glykanen. b Oberfläche der von Glykanen bedeckten Epitope entlang des MEP, quantifiziert durch Subtraktion der beiden mit und ohne Glykane berechneten AbASA-Werte. Alle Berechnungen der zugänglichen Oberfläche wurden mit einer 7-Å-Sonde durchgeführt.

Bemerkenswert ist, dass die Epitope der hier ausgewählten Antikörper im NTD und RBD des Spike liegen, den primären Regionen der Mutationsvarianten mit wirksamer Neutralisierungsumgehung5,62,63. Zu den betroffenen Antikörpern gehören STE90-C11, 4-8, S2M11, BD-368-2 von Omicron BA.162,64,65 und erhöhtes S309-Escape von Omicron BA.2, BA.4/BA.563. Im letzteren Fall betrifft der Neutralisierungsverlust eine Region in der Nähe des N343-Glykans, was die wichtige Rolle von Glykanen bei der Immunantwort unterstreicht.

Eine SARS-CoV-2-Infektion wird ausgelöst, wenn ein ACE2-Rezeptor an das S-Protein bindet, das zwischen dem Aufwärts- und dem Abwärtszustand wechselt, wobei nur der Aufwärtszustand die ACE2-Bindung zulässt. Folglich steuert die Energie der gegenseitigen Umwandlung die Auslösung einer Infektion. Zu diesem Zweck haben wir eine zweidimensionale Energielandschaft der Auf-Ab-Umwandlung des SARS-CoV-2-S-Proteins berechnet. Mithilfe von insgesamt 160 μs an REUS-Berechnungen erläutern wir die kollektive Rolle von S-Protein-Glykanen in seiner Öffnungsdynamik. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die freie Energiebarriere der Spike-Öffnung in Gegenwart von Glykanen etwa 7 kcal/mol höher ist als bei vollständig nicht glykosyliertem Spike. Während die freie Energie den Down-Zustand in Gegenwart der Glykane stark begünstigt, verringerte sich der Energieunterschied zwischen den beiden Zuständen des S-Proteins ohne Glykane unter den statistischen Fehler. Man kann davon ausgehen, dass mehr Up-State-S-Proteine ​​eine höhere Chance zur Bindung von ACE2-Rezeptoren bieten und somit die virale Fitness erhöhen würden. Es gibt jedoch einige gegenteilige Auswirkungen, wenn mehr S-Proteine ​​im Up-State vorhanden sind, wie in früheren Studien26,66 gezeigt und durch unsere Analyse erneut bestätigt. Die RBD ist im unteren Zustand stark durch Glykane abgeschirmt20,26, während sie im oberen Zustand stärker neutralisierenden Antikörpern ausgesetzt ist (Abb. 6a). Darüber hinaus hängt die ACE2-Bindung stark von der Bindungsaffinität zwischen ACE2 und dem S-Protein ab, was Wechselwirkungen mit Glykanen und Proteinen beinhalten kann. Daher spiegelt eine hohe Bevölkerung im Landesinneren nicht unbedingt eine hohe ACE2-gebundene Bevölkerung im Bundesstaat wider.

Die hier und anderswo beschriebene Beschreibung auf atomarer Ebene26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 wird angesichts der zentralen Rolle, die die Dynamik bei der Funktion des Spike-Proteins spielt, besonders relevant. Obwohl Kryo-EM-Strukturen ein zentrales Element bei der Beschreibung dieser Zustände waren, sind die Übergänge zwischen ihnen sowie Zwischenzustände nicht verfügbar. MD bietet ein ergänzendes Werkzeug zu diesen experimentellen Studien, um ein vollständigeres Bild der Funktionsweise dieser Proteine, einschließlich der kinetischen Wirkungen veränderter Glykane, zu erhalten. Darüber hinaus sind selbst die relativen Bevölkerungszahlen der Down- und Up-Staaten nicht frei von Unsicherheit. Obwohl zum Beispiel die aktuelle Kryo-EM-Struktur der Omicron-Ektodomänen-Variante überwiegend 1-up-RBD67 aufweist, werden alternative Populationen gemeldet68 und der Spike in voller Länge scheint ein Ensemble von 2-up/1-down-RBDs zu unterstützen69. Eine solche Konformationsvielfalt ist wahrscheinlich das Ergebnis alternativer Konstrukte und/oder experimenteller Bedingungen68.

Die Epitope von Antikörpern auf dem Spike können entweder durch Proteinreste oder durch Glykane geschützt werden, und die von jedem bereitgestellte Abdeckung ändert sich in epitopabhängiger Weise entlang des Spike-Öffnungspfads. Der STE90-C11-Antikörper weist die größte Epitop-Exposition auf, wenn die RBD oben ist, während der BD-368-2-Antikörper ein Epitop aufweist, das immer deutlich exponiert ist, unabhängig von der Position der RBD. Darüber hinaus ist die Exposition des BD-368-2-Epitops dem Epitop von STE90-C11 im Up-Zustand sehr ähnlich. Daher zeigen diese beiden Antikörper eine sehr hohe Effizienz bei der Neutralisierung des SARS-CoV-2-S-Proteins, beide mit subnanomolaren IC50-Werten56,59. Der CR3022-Antikörper bindet an ein kryptisches Epitop; Folglich ist sein AbASA im Vergleich zu anderen Epitopen kleiner. Der Mangel an freiliegender Oberfläche, selbst im oberen Zustand, wird jedoch durch starke elektrostatische Wechselwirkungen an der Epitop-CR3022-Schnittstelle70 ausgeglichen. Beachten Sie, dass der S309-Fab an ein Proteoglykan-Epitop bindet, zu dem das Glykan an N343 gehört. Da jedoch der größte Teil des S309-Epitops nicht Teil des RBM ist, kann es sowohl im Down- als auch im Up-Zustand an das Spike-Protein binden58. Der Effekt kann durch Mutationen in der Nähe von N343 zunichte gemacht werden, wie bei der Omicron-Variante63 beobachtet.

Wir analysierten die Wechselwirkungen einzelner Glykane mit verschiedenen Domänen des S-Proteins anhand der beiden erhaltenen MEPs, eines mit und eines ohne Glykane. Die Glykane an N122 und N165 unterbrechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem öffnenden RBD-A und dem benachbarten NTD-B, destabilisieren den oberen Zustand und verschieben somit die Gleichgewichtspopulation im Vergleich zum nicht glykosylierten System in Richtung des unteren Zustands. Die Glykane an N165 und N343 stabilisieren auch den RBD-A-Down-Zustand, indem sie sich um das RBM wickeln. Umgekehrt dient das Glykan bei N343 als sogenanntes „Glykan-Tor“, das das RBM32 stützt, während das Glykan bei N165 dabei hilft, indem es mit Hilfe des Glykans bei N343 das Up-State-RBD-A unterstützt. Folglich stabilisieren diese beiden Glykane sowohl den unteren als auch den oberen Zustand und tragen zu einem lokalen Energieminimum für beide bei. Die komplizierte Rolle des Glykans bei N165 könnte widersprüchliche experimentelle Ergebnisse hinsichtlich der Frage erklären, ob die N165A-Mutation die Spike-Bindung erhöht oder verringert26,71.

Das Spike-Protein ist das Hauptziel neutralisierender Antikörper, präsentiert eine Reihe von Epitopen im Down- und Up-Zustand und ist die Grundlage für aktuelle Impfstoffe und Auffrischungsimpfungen5,15,16,17. Unter evolutionärem Druck mutiert der Spike schnell, wobei übertragbarere Varianten mit erhöhtem Antikörperaustritt entstehen5. Obwohl das Virus weiterhin mutiert, scheinen Impfstoffe und Auffrischungsimpfungen bislang einen ausreichenden Schutz zu bieten. Ein wirksamer Ansatz zur Behandlung der anhaltenden Pandemie besteht weiterhin darin, wichtige immunologische Regionen auf dem Spike zu identifizieren und zu bewerten, sowohl im Down- als auch im Up-Zustand sowie in den Übergängen zwischen ihnen, insbesondere da es den Anschein hat, dass der Spike weiterhin mutieren und möglicherweise gefährden wird aktuelle Impfstoffe/Booster. Angesichts der veränderten Struktur und Dynamik der SARS-CoV-2-Spike-Varianten11,25,67,68 ist eine detaillierte Beschreibung der Energetik und Kinetik für die Öffnung des Spike-Proteins erforderlich, und die hier beschriebenen rechnerischen Ansätze bieten eine wertvolle Ergänzung Instrument bei der Entwicklung wirksamer Behandlungsmethoden.

Abschließend berechneten wir die Energetik entlang des Spike-Öffnungspfads für das SARS-CoV-2-S-Protein mit Einblicken auf atomarer Ebene in die Rolle von Glykanen im Öffnungsprozess. Darüber hinaus haben wir hervorgehoben, wie sich die Energie der Spike-Öffnung auf die Kinetik der ACE2-Bindung und Epitop-Freilegung auswirkt. Diese Erkenntnisse, insbesondere die Konformationen entlang des Spike-Öffnungspfads, werden die Entwicklung wirksamer Nanokörper und Antikörper zur Bekämpfung der anhaltenden COVID-19-Krise erleichtern.

Wir haben die Auf- und Ab-Zustände basierend auf den Strukturen der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) von Walls et al.10 (PDB: 6VYB) und von Cai et al.12 (PDB: 6XR8) unter Verwendung von VMD72 modelliert. Die von Cai et al. beschriebene Down-State-Struktur. ist ein durch Detergens gereinigtes WT-S-Proteinkonstrukt voller Länge mit einer Auflösung von 2,9 Å12. Es weist mehrere entscheidende Unterschiede zu früher berichteten Strukturen auf: (i) besser aufgelöste NTD mit einer zusätzlichen Glykosylierungsstelle an N17, (ii) die WT-Sequenz in der zentralen Helix-/Loop-Region anstelle der vor der Fusion stabilisierenden 2PP-Mutation und ( iii) ein etwa 25 Reste langes Segment, Reste 828–853, das zuvor ungelöst war. Diese letztere Region grenzt an ein kritisches Lysin (K854), das einen Salzbrückenpartner für D614 darstellt. Der Verlust dieser Salzbrücke wird mit der erhöhten Infektiosität der D614G SARS-CoV-2-Stämme in Verbindung gebracht. Darüber hinaus lösten Cai et al.12 auch zwei zuvor fehlende Disulfidbindungen auf, eine im N-Terminus (C15-C136) und eine weitere im zentralen Helix-/Schleifenbereich (C840-C851). In unserem Modell wurden die fehlenden Reste in den Down-State-Strukturen mit dem SWISS-Modell73 unter Verwendung der 6XR8-Struktur als Vorlage hinzugefügt. Das Modell wurde an der Furin-Spaltungsstelle zwischen den Resten R685 und S686 gespalten. Der S1-Teil, der RBD und NTD enthält, ist in der 6XR8-Struktur im Vergleich zum 6VXX dichter gepackt, und der S2-Teil, der HR1 und CH enthält, ist zwischen ihnen ausgerichtet12. Der S1- und S2-Teil unseres Modells umfasst die Reste N14-R685 bzw. S686-S1147. Zehn Disulfidbindungen werden im S1-Teil zwischen den Resten C15-C136, C131-C166, C291-C301, C336-C361, C379-C432, C391-C525, C480-C488, C538-C590, C617-C649 und C662 hinzugefügt. C671 und fünf werden zum S2-Teil C738-C760, C743-C749, C840-C851, C1032-C1043 und C1082-C1126 hinzugefügt. Die fehlenden Teile im Up-Zustand wurden mithilfe des minimierten Down-State-Modells modelliert. Glykosylierungsstellen befinden sich auf N17, N61, N74, N122, N149, N165, N234, N282, T323, N331, N343, N603, N616, N657, N709, N717, N801, N1074, N1098 und N1134. Insgesamt sind in jedem Protomer 19 N-verknüpfte und 1 O-verknüpfte Glykane vorhanden, was insgesamt 60 Glykane für ein S-Protein-Trimer-Modell ergibt. Das Glykan an jedem Standort mit der höchsten Population in den Massenspektroskopiedaten von Crispin und Mitarbeitern19 wurde dem Standort mithilfe des von der Woods-Gruppe entwickelten GLYCAM-Webservers hinzugefügt (http://glycam.org)37,38. Die Glykanzusammensetzungen sind in Abb. S13 dargestellt. Fehlende Wasserstoffatome wurden allen Systemen hinzugefügt und anschließend in einer 195 × 193 × 212 Å3 großen Wasserbox solvatisiert. Wir haben Na+- und Cl−-Ionen hinzugefügt, um eine Salzkonzentration von ~0,150 M zu erreichen. Die Anzahl der Atome in Protein, Wasser, Glykan und Ionen wurde für REUS-Berechnungen gleich gehalten. Die Systeme (oben oder unten) enthalten insgesamt 758.531 Atome (63.312 Protein- und Glykanatome, 661 Na+, 652 Cl−) und 633.864 Atome (52.476 Proteinatome, 549 Na+, 546 Cl−) mit bzw. ohne Glykane. Der Unterschied in der Anzahl der Ionen ergibt sich aus (1) dem größeren Wasserkasten, der zur Aufnahme der Glykane benötigt wird, und (2) der negativen Ladung der Sialinsäure (in Abb. S13 mit Neu5Ac bezeichnet), die in den O-verknüpften Glykanen vorhanden ist.

Alle Simulationen wurden unter Verwendung von NAMD 2.1474,75 mit dem Protein-Kraftfeld CHARMM36m76, dem Glykan-Kraftfeld CHARMM3677 und dem TIP3P-Wasser78 durchgeführt. Jedes System wurde 5 ns lang äquilibriert, wobei die Temperatur und der Druck auf 310 K bzw. 1 atm festgelegt wurden, unter Verwendung der Langevin-Dynamik bzw. des Kolbens79. Durch den Einsatz von Wasserstoffmassenneuverteilung (HMR)80,81 wurde ein einheitlicher 4-fs-Zeitschritt verwendet. Die Fernelektrostatik wurde für jeden Zeitschritt mit der Partikelnetz-Ewald-Methode82 berechnet. Ein Nahbereichsgrenzwert für Lennard-Jones-Wechselwirkungen wurde auf 12 Å festgelegt, wobei eine Schaltfunktion bei 10 Å begann. Bindungen, an denen Wasserstoffatome beteiligt sind, wurden auf ihre Gleichgewichtslänge beschränkt, wobei der SETTLE-Algorithmus für Wassermoleküle und der SHAKE-Algorithmus für alle anderen verwendet wurde.

Nach der Äquilibrierung führten wir zwei unabhängige Metadynamiksimulationen entlang der beiden kollektiven Variablen d und ϕ (definiert in Abb. 1) für jedes System (WT glykosyliert, WT nicht glykosyliert und nicht glykosyliert mit Diprolin-Mutation) durch, eine ausgehend vom unteren Zustand und einer aus dem oberen Staat. Zur Konstruktion aller Sammelvariablen wurde das Colvars-Modul von NAMD verwendet83. Die Vorspannungen wurden mit einer Hügelhöhe von 0,2 kcal/mol, einer Breite von 1,0 Å und 1,0∘ für d bzw. ϕ und einer Rate von 1 ps−1 abgeschieden. Die Systeme waren auf d und ϕ im Bereich der Kryo-EM-Strukturen der Down- (PDB: 6XR8) und Up-Zustände (PDB: 6VYB) beschränkt. Die Temperatur wurde mittels Langevin-Dynamik bei 310 K gehalten und das Volumen konstant gehalten.

Anschließend haben wir die Metadynamik-Trajektorien verwendet, um die REUS-Läufe gemäß dem folgenden Verfahren zu starten. Für jedes System wurden zwei vorläufige PMFs generiert, eines aus der Down-State-Metadynamik und eines aus der Up-State-Metadynamik. Der Konformationsraum wurde in kleine Gitter unterteilt und jedes Gitter wurde im nächsten Schritt zu einem einzelnen REUS-Fenster. Fenster, deren PMFs aus der Down- und Up-State-Metadynamik unter einem bestimmten Schwellenwert liegen (Tabelle S2), wurden gelöscht und würden in der REUS-Simulation nicht verwendet. Für die übrigen Gitter haben wir eine Momentaufnahme entweder der Down- (Fdown) oder der Up-State- (Fup) Metadynamik-Trajektorie entsprechend dem Boltzmann-Gewicht ihres jeweiligen PMF ausgewählt.

Wenn Pdown > Pup, wurde für dieses Raster ein Schnappschuss aus der Trajektorie der Metadynamik im Down-Zustand ausgewählt und umgekehrt. Damit wurden 387 Fenster (181 von unten, 206 von oben) für das glykosylierte WT-System ausgewählt; 392 Fenster (79 von unten, 313 von oben) für das nicht glykosylierte WT-System; und 353 Fenster (119 von unten, 234 von oben) für das nicht glykosylierte System mit Diprolin-Mutation.

Für das glykosylierte System führten wir außerdem ein simuliertes Annealing der Glykane für alle aus den Metadynamiksimulationen extrahierten Schnappschüsse durch. Beginnend bei 1000 K wurden die Systeme in Schritten von 823 K, 677 K, 557 K, 458 K, 377 K und 310 K langsam auf die physiologische Temperatur abgekühlt. Jede Temperatur wurde 2 ns lang gefahren. Während der Simulation wurden alle Proteinatome fixiert und die Glykane, Wassermoleküle und Ionen konnten sich frei bewegen. Aufgrund der hohen Geschwindigkeiten der Atome bei 1000 K und 823 K wurde zusammen mit HMR ein Zeitschritt von 2 fs verwendet. Für Temperaturen kleiner oder gleich 677 K wurde mit HMR ein Zeitschritt von 4 fs verwendet. Andere Simulationsparameter waren identisch mit den zuvor verwendeten. Es wurde bestätigt, dass die endgültigen Ringkonformationen der Glykane mit den erwarteten Werten übereinstimmten (Abb. S14).

Nachdem die anfänglichen Konfigurationen vorbereitet waren, führten wir REUS-Simulationen für jedes System entlang d und ϕ innerhalb der gemäß der Metadynamiksimulation PMF ausgewählten Regionen durch. Die Bereiche von d und ϕ reichen von 44,0 Å bis 72,5 Å bzw. –56,0∘ bis 1,0∘. Die Rückhaltekraftkonstanten entlang d und der Fenstermitten wurden angepasst, um eine ausreichende Überlappung und einen ausreichenden Austausch zwischen benachbarten Fenstern sicherzustellen. Die Kraftkonstanten entlang ϕ wurden konstant bei 1,0 kcal mol−1deg−2 gehalten. Die REUS-Simulationen des glykosylierten WT-Systems, des nicht glykosylierten WT-Systems und des nicht glykosylierten Systems mit Diprolin-Mutation wurden für 32 ns, 36 ns bzw. 29 ns durchgeführt. Die Simulationsparameter waren identisch mit denen, die in den Metadynamiksimulationen verwendet wurden. Die Stichprobendaten von REUS wurden verwendet, um die PMF für jedes System mithilfe des Multistate Bennett Acceptance Ratio (MBAR) zu berechnen, das im Python-Modul pymbar84 implementiert ist. Für die glykosylierten und nicht glykosylierten WT-Systeme führten wir drei weitere Runden von REUS-Simulationen durch, wobei wir Schnappschüsse verwendeten, die aus den vorherigen Runden extrahiert wurden, auf ähnliche Weise wie für die Metadynamiksimulationen. Für die zweite Runde wurden die Simulationsregionen mithilfe eines neuen Energiegrenzwerts auf der Grundlage der aus der ersten REUS-Runde berechneten PMFs neu ausgewählt (Tabelle S2). Auch die Rückhaltekraftkonstanten und die Fenstermitten wurden neu kalibriert. Die zweite REUS-Runde für die glykosylierten und nicht glykosylierten WT-Systeme wurde 37 ns bzw. 56 ns lang durchgeführt. Angesichts des Ergebnisses der zweiten REUS-Runde führten wir eine dritte REUS-Runde durch und erweiterten den PMF-Bereich, um die beiden Energiequellen vollständig abzudecken. In der dritten Runde wurden für jede Energiequelle zwei unabhängige REUS-Simulationen durchgeführt. Die Bereiche von d und ϕ lagen zwischen 40,5 Å und 51,0 Å bzw. zwischen –66,5∘ und –21,5∘ für den Down-State-REUS. Die Bereiche von d und ϕ lagen zwischen 57,5 ​​Å und 99,5 Å bzw. –35,5∘ bis 45,5∘ für das REUS im Oberland. Neue Metadynamiksimulationen wurden durchgeführt, um Regionen zu säen, die in früheren REUS-Simulationen noch nie beprobt wurden. Auch hier wurden die Fenster auf der Grundlage einer neuen Energieabschaltung ausgewählt (Tabelle S2) und die Rückhaltekraftkonstanten sowie die Fenstermitten wurden kalibriert, um die Überlappung und den Austausch zwischen benachbarten Fenstern zu maximieren. Die dritten Runden von REUS für die WT-glykosylierten Down- und Up-State-Systeme wurden jeweils 16 ns und 12 ns lang durchgeführt, und die für das nicht glykosylierte System betrugen 33 ns bzw. 28 ns. Schließlich wurde eine letzte REUS-Runde durchgeführt, um den gesamten Bereich vom unteren bis zum oberen Zustand abzudecken. Alle Fenster aus den Runden 2 und 3 wurden übernommen, wobei an den Rändern einige hinzugefügt wurden, um sicherzustellen, dass alle Bereiche mit niedriger Energie abgedeckt wurden (Tabelle S2). Der REUS für das nicht glykosylierte WT-System wurde 36 ns lang direkt unter Verwendung der letzten Frames aus früheren REUS-Runden ausgeführt. Für das glykosylierte System haben wir aus dem nicht glykosylierten REUS neue Keimstrukturen für Fenster rund um die Energiebarriere generiert, um die Lücke zwischen den Strukturen im unteren und oberen Zustand in der Simulation des glykosylierten REUS zu schließen. Unter Verwendung der Strukturen aus früheren REUS-Runden und der neu generierten Strukturen aus der abgeschlossenen nicht-glykosylierten REUS-Simulation wurde das glykosylierte REUS 36 ns lang ausgeführt. Die für die WT-Systeme dargestellten Daten basieren auf der Kombination der Daten der zweiten bis letzten REUS-Runde. Die Gesamtaggregationszeit der Simulationsdaten, die für das glykosylierte WT-System, das nicht glykosylierte WT-System und das nicht glykosylierte System mit Diprolin-Mutation REUS verwendet wurden, betrug 65 μs, 91 μs bzw. 12 μs.

Für Gleichgewichtssimulationen wurden zwei mit unterschiedlichen Zufallsstartwerten initialisierte Replikate ausgeführt. Darüber hinaus haben wir die Konvergenz unserer PMFs anhand der von MBAR bereitgestellten Unsicherheiten bewertet und sie liegen alle unter 0,2 kcal/mol, außer an den Rändern der PMFs.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Quelldaten für PMFs in Abb. 2 werden als Ergänzungsdaten 1 bereitgestellt. S-Protein-Konformationen, der MEP für jedes der drei PMFs und NAMD-Konfigurationsdateien sind im NSF MolSSI COVID-19 Molecular Structure and Therapeutics Hub unter https verfügbar ://covid.molssi.org/simulations/#pmf-calculations-of-sars-cov-2-spike-opening.

VMD und NAMD sind unter https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ bzw. https://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/ verfügbar. Die verwendete MBAR-Implementierung ist unter https://github.com/choderalab/pymbar verfügbar.

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Das COVID-19 High Performance Computing Consortium stellte eine Vergabe von Computerzeit auf dem Summit-Supercomputer im Oak Ridge National Laboratory zur Verfügung. Zusätzliche Rechenressourcen wurden durch das Extreme Science and Engineering Discovery Environment (XSEDE; TG-MCB130173) bereitgestellt, das von der National Science Foundation (NSF; ACI-1548562) unterstützt wird. Bei dieser Arbeit wurde auch der Hive-Cluster genutzt, der von der NSF unter der Fördernummer 1828187 unterstützt und von der Partnership for an Advanced Computing Environment (PACE) am Georgia Institute of Technology verwaltet wird. Die Autoren danken Mahmoud Moradi für seine Hilfe bei der Berechnung der mittleren ersten Durchgangszeit. YTP wird durch ein Frontera-Stipendium des Texas Advanced Computing Center (TACC) unterstützt. Frontera wird durch den NSF-Zuschuss Nr. OAC-1818253 unterstützt.

Atanu Acharya

Aktuelle Adresse: BioInspired Syracuse und Department of Chemistry, Syracuse University, Syracuse, NY, 13244, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yui Tik Pang, Atanu Acharya.

Fakultät für Physik, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, 30332, USA

Yui Tik Pang, Atanu Acharya, Diane L. Lynch, Anna Pavlova und James C. Gumbart

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Von YTP, AA, DLL und JCG konzipierte Forschung; YTP, AA, DLL und AP führten Recherchen durch und analysierten Daten; und alle Autoren haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit James C. Gumbart.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Elisa Fadda, Peter Coveney und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Pang, YT, Acharya, A., Lynch, DL et al. Die Dynamik und Energetik der SARS-CoV-2-Spike-Öffnung enthüllt die individuellen Rollen von Glykanen und ihre kollektive Wirkung. Commun Biol 5, 1170 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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Eingegangen: 01. September 2021

Angenommen: 20. Oktober 2022

Veröffentlicht: 03. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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