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Aug 04, 2023

Effiziente Modifikation und Vorbereitung zirkulärer DNA für die Expression in Zellkulturen

Band Kommunikationsbiologie

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1393 (2022) Diesen Artikel zitieren

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DNA-Plasmide sind ein wesentliches Werkzeug für die Abgabe und Expression von RNAs und Proteinen in Zellkulturexperimenten. Die Herstellung von Plasmiden erfordert typischerweise einen mühsamen Prozess der Klonierung, Validierung und Reinigung von Bakterien. Während die Expressionsplasmide bei Vertragsherstellern entworfen und bestellt werden können, können die Kosten unerschwinglich sein, wenn eine große Anzahl von Plasmiden erforderlich ist. Wir haben eine effiziente vollsynthetische Methode und ein Protokoll entwickelt, die die Produktion von zirkularisierter DNA mit transfektionsbereiten Expressionselementen in nur 3 Stunden ermöglichen und dadurch die bakteriellen Klonierungsschritte eliminieren. Das Protokoll beschreibt, wie man ein lineares doppelsträngiges DNA-Fragment nimmt und dieses DNA-Fragment mit minimalem Zeitaufwand effizient zirkularisiert und reinigt. Als Beweis für das Prinzip verwendeten wir Circular Vector, der gentechnisch veränderte Prime-Editing-Guide-RNA (epegRNA) exprimiert, in Zellkulturen und zeigten eine vergleichbare und sogar übertreffende Leistung dieser Methode im Vergleich zu durch Plasmide exprimierten Guides. Die schnelle Vorbereitung, die geringen Kosten und die einfache Anwendung der Methode machen sie zu einem nützlichen Werkzeug bei Anwendungen, die die Expression kurzer RNAs und Proteine ​​erfordern.

Es gibt viele Techniken für die Vorbereitung und Bereitstellung von RNAs und Proteinen für die vorübergehende Expression in Zellkulturen1. In dieser Studie stellen wir eine neue und effiziente Zubereitungsmethode vor. Zur Demonstration beschreiben wir die Verwendung unserer Methode im Anwendungskontext der Genbearbeitung. Da das Prinzip dieser Methode jedoch generisch ist, kann diese Methode für eine Vielzahl von Zwecken und Anwendungen nützlich sein, die die Expression von RNAs und Proteinen erfordern. Obwohl wir die spezifische Implementierung der Genbearbeitung diskutieren und unsere Methode mit einigen bestehenden Vorbereitungstechniken vergleichen werden, besteht das Ziel dieses Artikels darin, einen neuen Ansatz zur Vorbereitung der Expressionsvektoren in einer Laborumgebung vorzustellen – und nicht eine effizientere Methode zur Genbearbeitung solch.

Die drei gebräuchlichsten Ansätze, die das Editieren von Genen erleichtern, wenn sie in Zellen eingebracht werden, sind: (I) einzelne oder mehrere Plasmide2, die Cas9 und andere ergänzende Proteine ​​kodieren, und Implementierungen von Guide-RNA, die für traditionelles CRISPR/Cas9, Base Editing, Prime Editing oder andere Methoden geeignet sind3,4 ,5,6; (II) Cas9-mRNA und Guide-RNA7; (III) Cas9-Protein komplexiert mit Guide-RNAs8. Derzeit werden verschiedene Verabreichungsmethoden der oben genannten Geneditierungskonstrukte verwendet. Die Wahl der Verabreichungsmethode hängt von den spezifischen Anforderungen und den Vorlieben des Forschers ab. Dazu können Elektroporation9,10, Lipofektion11, direkte physikalische Transfektion12, Vektorabgabe auf Polymerpartikeln und Mikroträgern13 sowie Modalitäten der oben genannten Methoden gehören.

Der Ansatz (I), die Genbearbeitung mittels Plasmidtransfektion für die vorübergehende Expression, wird aufgrund seiner konzeptionellen Einfachheit, einfachen Handhabung und der Stabilität von Plasmiden häufig verwendet. Die Herstellung von Plasmiden ist jedoch ein arbeitsintensiver und zeitaufwändiger Prozess, der normalerweise zwei Tage dauert2 (siehe typische Schritte zum Klonen von Bakterien in der Ergänzenden Anmerkung 1).

Wir haben eine effiziente vollsynthetische Methode und ein Protokoll entwickelt, die die Produktion von zirkularisierter DNA mit transfektionsbereiten Expressionselementen in nur 3 Stunden ermöglichen und dadurch die bakteriellen Klonierungsschritte eliminieren. Zirkularisierte DNA ist resistent gegen den Exonuklease-Abbau im Zytoplasma14. Der linearen DNA mangelt es an dieser Stabilität, was ein erhebliches Hindernis für ihre Verwendung zur Genübertragung darstellt. Darüber hinaus macht sich unsere Methode diesen Unterschied in den Eigenschaften zunutze, indem sie Exonuklease verwendet, um nicht reagierte oder falsch reagierte lineare DNA-Fragmente zu verdauen und so die zirkuläre DNA zu reinigen.

Wir haben festgestellt, dass der praktische Bereich der Länge des Expressionsvektors zwischen 450 und 950 bp liegt, wo eine Effizienz von bis zu 62 % bei der Umwandlung der eingegebenen linearen doppelsträngigen DNA (dsDNA) in die zirkulären Expressionsvektoren erreicht wird; Die Methode könnte mit geringerer Effizienz auch für etwas längere Fragmente eingesetzt werden. Der Kürze und Konsistenz halber und um Verwechslungen mit der Beschreibung der Vorbereitungsschritte und des Endprodukts in diesem Dokument zu vermeiden, bezeichnen wir dieses zirkuläre DNA-Expressionsvektorkonstrukt und die Methode als „zirkulärer Vektor“, großgeschrieben und kursiv.

Um zu zeigen, dass solche zirkulären DNA-Konstrukte als Expressionsvektoren fungieren können, haben wir diese Methode angewendet, um zirkuläre DNA für die Expression der manipulierten Prime-Editing-Guide-RNA (epegRNA)5,15,16 zu erzeugen, und wir haben drei von Chen vorgestellte genomische Stellen erfolgreich bearbeitet et al.15, was zu einer vergleichbaren Bearbeitungseffizienz führt.

Ziel dieser Forschung war die Entwicklung und Validierung einer effizienten Einzelröhrchen-Vorbereitungsmethode für die Abgabe und Expression von RNAs und Proteinen in Zellkulturexperimenten. Die Zirkularisierung der Hauptbearbeitungsleitfäden wurde gemäß dem im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen Protokoll durchgeführt und in Abb. 1 schematisch dargestellt.

ein Expressionselement, das Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme vom Typ IIS mit komplementären Überhängen an beiden Enden des DNA-Fragments enthält. b Schnitte durch das Restriktionsenzym und Ligation der resultierenden Überhänge bilden das zirkuläre DNA-Expressionselement. T5-Exonuklease wird verwendet, um die gesamte nicht zirkularisierte DNA zu verdauen. c Schematische Ansicht der komplementären 4nt-Überhänge (gtac), die durch Restriktionsenzymschnitte (BsaI GGTCTC) erzeugt werden. Ein detailliertes Beispiel für die Prime-Editing-epegRNA-Kodierung finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. Protokollschritte: (d) Pipettieren Sie die dsDNA-Matrize mit T4-DNA-Ligase und geben Sie sie ein IIS-Restriktionsenzymreagenzien, dann programmieren Sie die Inkubation bei 37 °C für 1 Stunde (oder länger, falls gewünscht), gefolgt von der Hitzeaktivierung der T4-DNA-Ligase bei 65 °C für 15 Minuten. Wenn Sie es unbeaufsichtigt lassen, stellen Sie den Programmzyklus auf eine Pause bei 4 °C ein. e Geben Sie ein gleiches Volumen an T5-Exonuklease-Reagenzien in dasselbe Röhrchen und verdauen Sie es 1 Stunde lang bei 37 °C. f Reinigen Sie das zirkularisierte DNA-Expressionskonstrukt mit einem DNA-Reinigungskit aus dem Reaktionsgemisch.

Die relative Ausbeute der Reaktion (siehe Abb. 2a) ist in Gleichung definiert. (1) durch das Verhältnis der Menge an zirkularisierter DNA nach der Reinigung zur theoretisch maximal möglichen Ausbeute unter Ausschluss der Restriktionsenzymstellen und der DNA-Endpolsterung oder PCR-Adapter (siehe ergänzende Abbildung 1 und weitere Beschreibung im Abschnitt „Methoden“). Die typische Länge des zirkularisierten PEmax-epegRNA-Expressionskonstrukts würde zwischen 450 und 500 bp liegen, einschließlich des Promotors und der Sequenz, die für pegDNA mit der End-RNA-Schleife kodiert, wie in Chen et al.15 beschrieben. Für diese Forschung haben wir einen zirkulären Vektor mit 452 bp ausgewählt, der für eine einzelne Nukleotidsubstitution im HBB-Gen15 kodiert. Wir haben einen Satz dsDNA mit unterschiedlichen Fülllängen entworfen, der aus randomisierten dsDNA-Sequenzen besteht, um zu testen, wie die Ausbeute von der eingegebenen dsDNA-Länge und der Dauer des Zirkularisierungsschritts (Ligation) abhängt. Das Hinzufügen einer solchen DNA-Auffüllung von 100, 300, 500, 880 und 1330 bp zu einem zirkulären Vektor mit bloßen Knochen von 452 bp führte zu kreisförmigen Vektoren mit 552, 752, 952, 1332 und 1782 bp (siehe ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus haben wir eine verkürzte zirkularisierte Struktur mit 282 bp getestet, die zu kurz war, um einen funktionellen Expressionsvektor in unserer Implementierung zu enthalten, aber aus der Perspektive der Überprüfung des Verhaltens potenziell kürzerer Konstrukte interessant war.

a Relative Ausbeute bei einem Bereich von eingegebenen DNA-Längen nach 1, 2 und 12 Stunden Zirkularisierung. Die Linienknoten stellen die Durchschnittswerte von n = 2–3 unabhängigen Reaktionsproben dar; Die Punkte zeigen einzelne Datenbeispiele für die Knoten, horizontal versetzt zur besseren Sichtbarkeit. b Gelelektrophorese-Kombinationsbild. In jedem Unterplot gilt: Spur 1 = 1 Stunde, Spur 2 = 2 Stunden und Spur 3 = 12 Stunden Zirkularisierung. Die DNA-Menge wurde in Teilparzellen von 282–952 bp auf 300 ng pro Spur normalisiert. Um eine Überlastung aufgrund der geringen Anzahl von Banden zu vermeiden, wurde die DNA-Menge für die Teilplots mit 1332 und 1782 bp auf 150 ng pro Spur normalisiert. Die Spuren in jedem Unterplot sind eine Teilmenge von Spuren aus derselben einzelnen Gelplatte für jede Länge des kreisförmigen Vektors, die nur beschnitten wurde, um die Anzahl der Spuren ohne jegliche Bildverbesserung zu reduzieren; Die vollständigen Gelfotos sind in den Zusatzdaten verfügbar. c Schematische Darstellung der Selbstzirkularisierung und der Verbindung wiederholter Mehrfachfragmente.

Die relative Ausbeute des Protokolls für die getesteten Zirkularvektorlängen und Zirkularisierungsdauern ist in Abb. 2a dargestellt. Bemerkenswerterweise war die Ausbeute für den zirkulären DNA-Längenbereich am höchsten, der mit den Längen unserer primären Editierungsvektoren übereinstimmte (bei oder über 450 bp). Abgesehen von dieser Hochertragsspitze blieb der Ertrag relativ konstant und fiel bei Längen über 1000 bp rasch ab.

Die Ergebnisse der Gelelektrophorese zeigen ein Bild, das ausschließlich zirkularisierte DNA in mehreren Banden enthält (siehe Abb. 2b). Wie erwartet führten einige Ligationen zusätzlich zur Einzeleinheitszirkularisierung zu doppelten, dreifachen und Konkatemeren höherer Ordnung, die schematisch in Abb. 2c dargestellt sind. Diese Hypothese wurde durch Ausschneiden, Reinigen und Sequenzieren einzelner Banden sowie durch erneutes Durchführen einer Gelelektrophorese an DNA, die aus einzelnen Banden gereinigt wurde, bestätigt. In jedem Fall bestätigte die Sanger-Sequenzierung die perfekte Übereinstimmung zwischen den Designs und den konstruierten kreisförmigen Vektoren. Der Großteil der Zirkularisierung fand innerhalb der ersten Stunde statt, überstieg 48 % bei einer Größe von 452 bp und sank auf 26 % bei 952 bp, was sie zu einer praktisch nützlichen Methode in diesem gesamten Längenbereich macht. Es überrascht nicht, dass die Ausbeute mit zunehmender Zirkularisierungs-/Ligationsdauer noch weiter zunahm, der Anteil von Kombinationen höherer Ordnung jedoch auch mit der Ligationsdauer zunahm (siehe Gelbilder in Abb. 2b).

Die Analyse der Gelelektrophoresebilder mit der ImageJ-Software17 der National Institutes of Health zeigte, dass die höhere Bandendarstellung nach DNA-Gewicht mit der Zirkularisierungsdauer leicht zunahm (siehe Abb. 3a). Dies fällt besonders auf, wenn man Band 1 (einzelne zirkuläre DNA, blaue Linie) mit dem kumulativen Wert von Band 3 und höher (gelbe Linie) vergleicht. Nur bei einer kreisförmigen Vektorgröße von 282 bp repräsentiert Simplex-Band 1 weniger als Band 2 und weniger als den kombinierten Wert von Band 3 und höher der Vektoreinheiten nach Gewicht in der Reaktionsausgabe.

Wir zeigen das erste, zweite und die Summe der dritten und höheren Bänder, die einfachen, doppelten und der Summe der Konkatemer höherer Ordnung entsprechen. Die Linienknoten stellen die Durchschnittswerte von n = 2 unabhängigen Reaktionsproben dar, berechnet aus der Helligkeit der Gelelektrophoresebande; Die Punkte zeigen einzelne Datenbeispiele für die Knoten, horizontal versetzt zur besseren Sichtbarkeit. a Das relative DNA-Gewicht entspricht der relativen Bandenhelligkeit. b Die relative Molarenzahl der Banden wird als relative Bandhelligkeit dividiert durch die Bandenzahl gezählt (siehe auch Gleichung (2)).

Die Anzahl der molaren Einheiten ist für Band 1 immer relativ hoch, da die molare Darstellung proportional zum DNA-Gewicht der Bande dividiert durch die Bandennummer ist (siehe Abb. 3b). Bei einer Ligationsdauer von 1 Stunde in einem kreisförmigen Vektor mit einer Länge zwischen 450 und 950 bp macht Band 1 einen molaren Anteil von etwa 70 % aus, wobei Band 2 weitere 20 % ausmacht und die Banden höherer Ordnung zusammen die verbleibenden 10–15 ausmachen %. Nach 12 Stunden Ligation verschiebt sich der Anteil von Band 1 um ca. 6 % nach unten, während Band 2 eher konstant bleibt und der Anteil der kombinierten höheren Banden um ca. 6 % zunimmt. Dies stellt eine Erhöhung der Gewichtung der Bänder höherer Ordnung mit minimalem, wenn überhaupt, zusätzlichem Ertrag für die kreisförmigen Vektoren mit einer Einheit dar.

Umgekehrt verbinden sich oberhalb von 1000 bp die höheren Banden zu einem molaren Anteil von unter 5 %. Aufgrund ihrer geringen Ausbeute von 5–8 % halten wir diese längeren kreisförmigen Vektoren jedoch für praktisch nicht nützlich für unsere Methode. Wir gehen davon aus, dass diese Änderungen in der Länge der eingegebenen DNA für die Ausbeute und Fraktionsverteilung verbundener Circular Vector-Konkatemeren – einschließlich des scheinbaren Anstiegs der Ausbeute um 450 bp – wahrscheinlich durch eine Kombination aus DNA-Länge und Faltungsmustern verursacht werden, die durch den pH-Wert der Reaktionsmischung beeinflusst werden. Ioneneinflüsse und die Reaktionstemperatur18.

Während die Mehrzahl der zirkulären Vektoren zahlenmäßig aus Einzel- und Doppeleinheiten besteht, sind die Konkatemer höherer Ordnung gewichtsmäßig überproportional vertreten. Für die Transfektion ist es wichtig, einen molaren Anteil des Cas9-tragenden Plasmids und des Leitplasmids berechnen zu können. Die Effizienz der Plasmidtransfektion beträgt immer <100 % der Zellen und variiert je nach Zelltyp, Größe des/der Plasmid(e) und Transfektionsmethoden. Die Bestimmung des perfekten Verhältnisses bei der Co-Transfektion zweier Plasmide ist mühsam19, und wenn zwei co-transfizierte Plasmide unterschiedlich groß sind, wird üblicherweise ein molarer Überschuss des kleineren Plasmids verwendet, siehe beispielsweise Bosch et al.20. In unseren Prime-Editing-Validierungsexperimenten sind die Circular Vectors fünfmal kleiner als die Plasmide, die epegRNA16 exprimieren, die sie ersetzen, während diese epegRNA-Plasmide16 selbst etwa fünfmal kleiner sind als die passenden Cas9-exprimierenden Plasmide15 (siehe weitere Diskussion). Daher berechnen wir mithilfe von Gleichung (2) einen „molaren Multiplikator“, der angibt, um wie viel mehr Circular Vector nach Gewicht im Vergleich zum Fall eines reinen Single-Unit-Circular Vector verwendet werden muss. Die molaren Multiplikatorwerte für 1 h und 12 h Ligation in Abb. 4a deuten darauf hin, dass eine längere Ligationszeit zu einem Anstieg des Molverhältnisses aufgrund einer vorherrschenden Zunahme des höheren Bandenanteils führt.

ein molarer Multiplikator nach Länge und Zirkularisierungsdauer. Zwischen 452 bp und 952 bp gilt als einfache Faustregel, die auf der Verteilung basiert, ein 1,5-facher Multiplikator nach 1 Stunde Zirkularisierung und 1,7 × für 2 Stunden Zirkularisierung oder länger. Wenn beispielsweise das Cas9-Plasmid 13.000 bp lang ist und der einzelne zirkuläre Vektor 452 bp lang ist, dann erfordert 1,0 μg des Hauptplasmids im Molverhältnis 1:1 1,0 × 452/13.000 = 0,035 μg = 35 ng. Eine Multiplikation mit 1,5 ergibt 52 ng eines Vektors statt 35 ng bei einem Molverhältnis von 1:1, basierend auf einer einstündigen Zirkularisierungsreaktion. Die Linienknoten stellen die Durchschnittswerte von n = 2 unabhängigen Reaktionsproben dar, berechnet aus der Helligkeit der Gelelektrophoresebande; Die Punkte zeigen einzelne Datenbeispiele für die Knoten, horizontal versetzt zur besseren Sichtbarkeit. b Validierung des kreisförmigen Vektors durch Erstbearbeitung von HBB, CDKL5 und PRPN.

Die Validierung der Circular Vector-Funktionalität erfolgte durch Erstbearbeitung der einzelnen Basensubstitutionen in der HEK293T-Zellkultur an drei Genomstandorten (d. h. HBB, PRPN und CDKL5), die von Chen et al.15 als Demonstration der verbesserten Effizienz von verwendet wurden ihre PEmax-Methode. Wir haben das Leitfadendesign anhand einer Studie von Nelson et al.16 in Verbindung mit dem Addgene-Plasmid Nr. 17482815,21 codiert, das durch die Hinzufügung eines Blasticidin-Resistenzgens modifiziert wurde, um eine Antibiotikaauswahl zu erleichtern. Wir verwendeten Gelelektrophorese, um die erste Bande aus den vorbereiteten HBB-, PRPN- und CDKL5-Circular-Vektoren zu reinigen und so den Single-Expression-Modul-Circular-Vektor zu erhalten. Wir haben auch einen Satz derselben drei Expressionseinheiten mit zusätzlicher 500 bp inaktiver DNA-Auffüllung vor dem U6-Promotor vorbereitet, wie oben beschrieben und in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt. Die Besonderheiten der Genbearbeitung sind im Abschnitt „Methoden“ Transfektion, Handhabung und aufgeführt Sequenzierung editierter HEK293T-Zellen. Wir haben bestätigt, dass die Verwendung eines 8-fachen Molverhältnisses des Circular Vector zu Cas9-Plasmiden im Vergleich zum 4-fachen Verhältnis zu einem vernachlässigbaren Unterschied in der Bearbeitungseffizienz führte, und haben daher alle hier beschriebenen Genombearbeitungsexperimente mit dem üblichen 4-fachen molaren Überschuss durchgeführt.

Die mit EditR22,23 durchgeführte Bearbeitungseffizienzanalyse ist in Tabelle 1 zusammengefasst und in Abb. 4b dargestellt. Es ist offensichtlich, dass die zirkulären Vektoren für die epegRNA-Expression funktionsfähig sind, wenn sie als Komponente des Prime-Editings verwendet werden, wobei ein 4-facher molarer Überschuss an zirkulären Vektoren gegenüber dem PE4max-Cas9-Plasmid verwendet wird. Die Bearbeitungseffizienz lag für zwei von drei bearbeiteten Standorten nahe an den PE4max-Ergebnissen von Chen et al.15 und übertraf die Bearbeitungseffizienz von Chen et al.15 für den dritten Standort – den PRNP-Locus – deutlich, was die funktionale Verwendung von bestätigte Kreisförmige Vektoren. Bemerkenswert ist, dass die Verwendung der durch unser Protokoll vorbereiteten Zirkularvektoren zu einer besseren Bearbeitungseffizienz führte als der gereinigte Einzelband-Zirkularvektor, was den Vorteil der Verwendung der Mischung, die einen Bruchteil von Concatemeren enthält, anstelle der einzelnen zirkularisierten Einheiten bestätigt. Die kreisförmigen Vektoren mit zusätzlicher Auffüllung von 500 bp zeigten eine um weitere 1–4 % höhere Bearbeitungseffizienz (in Tabelle 1 fett markiert).

Wir vermuteten zwei Mechanismen, die zu den in Tabelle 1 beobachteten Ergebnissen führten: (A) Möglicherweise interagieren sehr kurze – 452 bp – kreisförmige Einheiten etwas weniger effizient mit der Polymerase III als längere kreisförmige Strukturen24, und eine Verdoppelung der Länge könnte die Wechselwirkung etwas verstärken effizient, was den beobachteten geringen Effizienzanstieg zwischen den Säulen CV und CV+500 Pad erklären könnte, die die zusätzlichen 500 bp inaktiver DNA-Padding enthielten. Wenn maximale Bearbeitungseffizienz erforderlich ist, kann die zusätzliche DNA-Auffüllung problemlos in das kreisförmige Vektordesign integriert werden, wie in der ergänzenden Abbildung 1. (B) Der größere Anstieg der Bearbeitungseffizienz zwischen den Spalten Band 1 CV und CV kann durch ~ erklärt werden 1,5-mal größere Anzahl von Expressionseinheiten pro molarer Einheit der Concatemer-Mischung aus kreisförmigen Vektoren im Vergleich zu den einzelnen zirkularisierten Expressionseinheiten; außerdem werden die verketteten Kreisvektoren automatisch länger. Dies impliziert auch, dass eine längere Zirkularisierungsdauer, die zu einer höheren Darstellung verketteter Zirkularvektoren führt, die Bearbeitungseffizienz bei einem festen molaren Überschuss ebenfalls leicht verbessern kann.

Zusammenfassend zeigten die obigen Ergebnisse, dass mit unserem Protokoll hergestellte zirkuläre Vektoren mit 450–950 bp für die Lieferung und Expression von RNAs für die Verwendung als epegRNA-Expressionsvektoren beim Prime-Editing in Zellkulturen geeignet sind.

Die hier vorgestellte Zirkularisierungsmethode und das Zirkularisierungsprotokoll beschreiben, wie zirkuläre Vektoren hergestellt werden, die als effizienter Ersatz für die Leitplasmide bei CRISPR, der Bearbeitung von Basis- und Prime-Genen in Zellkulturen verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass nach dem Entwurf, der Bestellung und dem Erhalt von dsDNA von einem kommerziellen Lieferanten das für die Transkription bereite Produkt innerhalb von 3 Stunden und mit wenig praktischem Zeitaufwand für den Einsatz vorbereitet werden kann. Darüber hinaus besteht der Großteil der praktischen Zeit aus der grundlegenden DNA-Bereinigung des Spin-Column-Kits. Wenn die empfangene DNA-Menge gering ist und eine PCR-Amplifikation erforderlich ist, kann der Prozess eine zusätzliche Stunde dauern, um die erforderliche Menge an zugeführter DNA zu amplifizieren.

Es gibt zwei Hauptbeschränkungen oder Bedenken, die wir besprechen möchten:

Die Menge an kreisförmigem Vektor, die durch eine synthetische Reaktion erzeugt wird. Typischerweise ergibt eine einzelne 50-μl-Reaktion 2,0–2,5 μg Produkt. Obwohl die Reaktion mit mehr Reagenzien vergrößert werden kann, ist in Situationen, in denen eine große Menge an Vektoren benötigt wird, die Fähigkeit des bakteriellen Klonens, Milligramm Produkt in einem einzigen Maxi-Prep zu produzieren, die bessere Wahl. In den meisten Situationen werden an jeder Anleitung nur wenige Änderungen vorgenommen, sodass Einfachheit und Schnelligkeit der Vorbereitung unsere Zirkularisierungsmethode begünstigen.

Wir möchten die Fehlerquote diskutieren, die dem Herstellungsprozess von DNA-Fragmenten innewohnt. High Fidelity ist eine starke Variante der Methode zum Klonen von Bakterien. Die DNA-Replikationsfehlerrate von E. coli beim Klonen eines Plasmids wird auf 5 ⋅ 10−10 pro Basenpaar geschätzt25. Sobald eine E. coli-Kolonie, die ein perfektes Plasmid enthält, durch Sequenzierung identifiziert und geklont wird, ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Plasmid einen Fehler enthält, verschwindend gering, sofern Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden26.

Andererseits ist die von kommerziellen DNA-Fragment-Herstellern beworbene Fehlerquote recht hoch. Die Fehlerraten von DNA-Fragmenten mit einer Länge von weniger als 800 bp, die von drei Herstellern hergestellt werden, betragen: Twist Bioscience 1/6253 bp, Thermo Fisher Scientific 1/6757 bp und Integrated DNA Technologies 1/6757 bp. Bemerkenswerterweise behaupten sowohl Twist Bioscience27 als auch Thermo Fisher Scientific28, dass die tatsächliche Fehlerrate für gBlocks von Integrated DNA Technologies viel höher ist (1/2705 bzw. 1/1329).

Betrachten wir das Beispiel des Twist Bioscience-Herstellungsprozesses – mit einer Fehlerrate von 1/6253 bp – und unseres 452 bp großen Circular Vector mit 20 bp langem Targeting-Spacer. Somit beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass im Abstandshalter ein Fehler auftritt, etwa 20 ÷ 6,253 ≈ 1/312 für kreisförmige Vektoren. Höchstwahrscheinlich werden sie kein Ziel im Genom finden und könnten zu Bearbeitungsversuchen außerhalb des Ziels in einem sehr kleinen Teil dieses ohnehin schon kleinen Anteils von 1/312 potenziell nicht übereinstimmender Leitfäden führen. Diese Schlussfolgerung wird von Chavez et al.29 gestützt, die zeigten, dass Bearbeitungen gegenüber mehreren Fehlpaarungen zwischen der gRNA und dem ungeeignet gebundenen Locus tolerant sein können. Unter der Annahme, dass ein Fehler im 264-bp-Promotorbereich auftritt (siehe ergänzende Abbildung 1), bleibt er entweder funktionsfähig oder wird nicht mehr funktionsfähig. Wenn der Promoter nicht funktionsfähig ist, hat dies keinen Einfluss auf die Genauigkeit der Bearbeitung. Wenn der Fehler in den RNA-Gerüstbereich fällt, wird die epegRNA durch Linker, Verlängerung oder Endschleife höchstwahrscheinlich nicht mehr funktionsfähig sein, auch ohne Auswirkungen auf die Genauigkeit der Bearbeitung. Darüber hinaus werden in der Regel zirkuläre Vektoren im Überschuss zum Cas9-Plasmid bereitgestellt, und nicht-funktionelle zirkuläre Vektoren werden durch funktionale unterstützt.

Daher wird erwartet, dass die durch Circular Vectors eingeführte zusätzliche Fehlerrate um Größenordnungen niedriger ist als die, die durch das Prime-Editing selbst erzeugt wird, und in noch größerem Ausmaß, CRISPR/Cas9 und Base-Editing3,4,5,15,30, weil alle Bei diesen Methoden liegt der Grad der Abweichungen und Fehlbearbeitungen von Natur aus bei 4–15 %. Die mit EditR für unsere drei bearbeiteten genomischen Standorte durchgeführte Sanger-Spurenanalyse ergab keine erkennbaren Änderungen außerhalb des Ziels, was mit der oben genannten Argumentation übereinstimmt, dass Änderungen außerhalb des Ziels bei Verwendung der Circular Vectors-Methode, falls vorhanden, Größenordnungen betragen werden seltener als erfolgreiche Bearbeitungen.

In einigen Fällen, wenn mehrere RNAs exprimiert werden müssen, kann eine Lösung mit polycistronischen Leitfäden implementiert werden31. U6-Promotoren exprimieren RNA ohne zusätzliche Kernlokalisierungssequenzen, die auf einem Plasmid vorhanden sind16,32,33, und unsere Validierungsexperimente bestätigten dies für kreisförmige Vektoren. Bei der Implementierung anderer Promotoren muss das Design – ähnlich wie bei Plasmiden – möglicherweise die Kernlokalisierung sicherstellen34,35.

Es gibt bestimmte Situationen, in denen zwei oder mehr RNAs exprimiert werden müssen, die separate Promotoren erfordern, oder in denen mehrere Wiederholungen im gewünschten dsDNA-Design vorhanden sind. Beispielsweise erfordern die Prime-Editing-Methoden PE3 oder PE5max15 einen zweiten RNA-Guide, um einen zusätzlichen Nick zu erzeugen. Es gibt noch komplexere Szenarien6,36. In solchen Fällen können mehrere Elemente innerhalb eines kreisförmigen Vektors kombiniert werden. Die meisten Hersteller können keine DNA-Fragmente mit langen Wiederholungen herstellen (z. B. sich wiederholende Promotoren oder pegRNA-Gerüste). Allerdings kann dsDNA als separate Fragmente bestellt werden und durch die Durchführung des einfachen zusätzlichen Schritts der linearen Ligation kann eine kombinierte lineare dsDNA hergestellt werden, die anschließend mit der Circular Vector-Methode zirkularisiert werden kann (siehe ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Anmerkung 3: Lineare Verbindung von dsDNA-Fragmenten). ). Beispielsweise erfordern Prime Editing PE3 und PE515 zwei U6-Promotoren, die die Transkription von zwei RNA-Guides ermöglichen. Die entsprechenden Konstrukte werden üblicherweise mithilfe der Golden-Gate- oder Gibson-Assemblierung in einzelne Plasmidvektoren eingefügt, gefolgt von der bakteriellen Klonierung. In einem noch komplexeren Szenario erfordern viele Phasen des Zusammenbaus und des bakteriellen Klonens etwa eine Woche Arbeit und Handhabung36. Im Prinzip erfordert der Verbindungsschritt das Entwerfen und Ordnen von Fragmenten, die mit einem IIS-Restriktionsenzym vom Zwischentyp (dh BbsI in dem in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellten Beispiel) geschnitten werden können. Die Verbindung kann in ein paar Stunden erfolgen, mit einer einstündigen Reaktion in Schritt 1, die unter „Methoden“ beschrieben wird, gefolgt von einer DNA-Bereinigung, um kurze DNA-Endabschnitte zu verwerfen. Unserer Erfahrung nach ermöglicht eine solche lineare Ligation die Verknüpfung linearer dsDNA mit nahezu 100 % Effizienz, wobei Verluste hauptsächlich auf die Reinigung mit einem Spin-Säulen-Kit zurückzuführen sind. Auf diesen vorbereitenden Schritt kann dann die Zirkularisierung mithilfe des Circular Vector-Protokolls folgen, was dazu führt, dass der gesamte Prozess um ein Vielfaches schneller abgeschlossen wird als die vielen Schritte des bakteriellen Klonens. Darüber hinaus kann in Fällen, in denen ein reiner kreisförmiger Vektor mit einer einzigen Einheit erforderlich ist, dieser über Gelelektrophorese extrahiert werden.

Ein weiterer wichtiger Vorteil dieser Methode sind die geringen Kosten. Unser Kostenberechnungsbeispiel im Abschnitt „Reagenzien, Materialien und Kosten“ zeigt, dass die Fixkosten des linearen dsDNA-Fragments, das bei einem kommerziellen Lieferanten bestellt wird, 32,90 $ für einen 452 bp großen kreisförmigen Vektor betragen. Die Reaktion kostet nur 9,30 $. Wenn eine PCR-Amplifikation erforderlich ist, erhöht sich die Gesamtsumme um 4,76 $ und es ist nicht mehr erforderlich, die eingegebenen dsDNA-Fragmente bei einem Lieferanten nachzubestellen. Das Protokoll produziert 2,0–2,5 μg Circular Vector, was für mehr als 10 Bearbeitungen auf einer 24-Well-Platte (basierend auf den Mengen, die wir im Abschnitt „Schritt-für-Schritt-Protokoll“ verwendet haben) und ~40 Bearbeitungen auf einer 96-Well-Platte ausreicht Platte. Dies ist im Vergleich zum bakteriellen Klonen günstig, bei dem die Gesamtkosten vom Entwurf bis zum transfektionsbereiten Plasmid typischerweise um ein Vielfaches höher sind (zusätzlich zu einer viel längeren praktischen und Gesamtzeit). Noch teurer ist es, fertige Plasmide zu bestellen, wie in der Ergänzenden Anmerkung 5 am Beispiel der Preisgestaltung bei zwei Vertragsherstellern dargestellt, und noch teurer, vorgefertigte epegRNA zu bestellen.

In dieser Forschung stellten wir eine Zirkularisierungsmethode und ein Zirkularisierungsprotokoll für die Herstellung zirkulärer Vektoren vor, die in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können, die die Expression kurzer RNAs und Proteine ​​erfordern. Bei einer zirkulären Vektorlänge von 450 bp betrug die Effizienz der Umwandlung der eingegebenen DNA in zirkuläre Vektoren 48 % nach 1 Stunde Ligation und bis zu 62 % nach 12 Stunden Ligation. Bei einer Länge von 950 bp betrug diese Effizienz 26 % nach 1 Stunde Ligation und 30 % nach 12 Stunden Ligation, mit Zwischenwerten für kreisförmige Vektoren mit einer Länge zwischen 450 und 950 bp. Längere Reaktionszeiten führten zu einer gewissen Verbesserung der Ausbeute an kreisförmigen Vektoren. Ein kurzer 1-stündiger Ligationsschritt hat jedoch den Vorteil einer schnellen und effizienten 3-stündigen Verarbeitung von Anfang bis Ende.

Als Beweis für das Prinzip verwendeten wir Circular Vector, der epegRNA exprimiert, in Zellkulturen und zeigten eine vergleichbare und sogar übertreffende Leistung dieser Methode im Vergleich zur Plasmidabgabe, die von Chen et al.15 beschrieben wurde. Aufgrund seiner Geschwindigkeit, geringen Kosten und Benutzerfreundlichkeit wird diese Methode ein weiteres wertvolles Werkzeug im Gen-Editing-Toolkit sein, während die Einfachheit der Reaktion das Protokoll für automatisierte Liquid-Handling-Systeme geeignet macht37.

Mit dieser Methode, die aus einer zweistufigen Einzelröhrchenreaktion gefolgt von einer typischen Spin-Säulen-basierten DNA-Reinigung besteht, kann ein Forscher in 3 Stunden eine Charge kreisförmiger Vektoren herstellen. Die Circular Vector-Methode vereinfacht die Herstellung kleiner variabler Targeting-Komponenten, die in Verbindung mit einem unveränderlichen großen Plasmid funktionieren, das für Cas9 und/oder andere Proteine ​​und Gene kodiert. Dieses große Plasmid kann in großen Mengen in einer Bakterienkultur geklont, mit einem der kommerziell erhältlichen Maxi-Preps extrahiert und für nachfolgende monate- oder sogar jahrelange Experimente verwendet werden. Bemerkenswert ist, dass die variable Komponente für jedes Bearbeitungsziel – der Kreisvektor – jetzt ein Kinderspiel ist.

Zirkularisierte DNA ist resistent gegen den Exonuklease-Abbau im Zytoplasma14. Der linearen DNA mangelt es an dieser Stabilität, was ein erhebliches Hindernis für ihre Verwendung zur Genübertragung darstellt. Darüber hinaus macht sich unsere Methode diesen Unterschied in den Eigenschaften zunutze, indem sie die T5-Exonuklease verwendet, um nicht-reagierte oder fehlreagierte lineare DNA-Fragmente zu verdauen und so die zirkuläre Vektor-DNA zu reinigen.

Unsere Zirkularisierungsmethode für die CRISPR-Guidexpressionsvektoren erfordert ein anfängliches DNA-Sequenzdesign, das mit den bevorzugten Tools des Forschers erstellt werden kann (wir haben SnapGene 6.0.7 verwendet), gefolgt von der Bestellung von dsDNA-Fragmenten bei einem kommerziellen Hersteller.

Die vorgefertigte dsDNA sollte mindestens einen Promotor (in unserem Beispiel U6) enthalten, gefolgt von einem DNA-Segment, das für epegRNA mit einem Terminator kodiert (siehe Abbildung 1a und die detaillierte Karte in der ergänzenden Abbildung 1). Die epegRNA kann mit einem veröffentlichten, für diesen Zweck geeigneten Tool entworfen werden15,16,39. Zwei übereinstimmende Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme vom Typ IIS erzeugen komplementäre 4-nt-Überhänge in der Nähe beider Enden des dsDNA-Fragments. Der kreisförmige Vektor kann bequem mit der Sanger-Sequenzierung validiert werden (siehe Abb. 1b). Die Platzierung von zwei Primern, Sanger-1 und Sanger-2, in der Nähe der gegenüberliegenden Stellen der kreisförmigen Struktur hat sich als effizient und zuverlässig erwiesen und deckt den größten Teil der kreisförmigen Struktur mit der Überlappung ab, die den gegenüberliegenden Primer in der Nähe der Mitte der FASTA-Sequenz einschließt. Wenn die gesamte Plasmidsequenzierung bevorzugt wird, benötigen Unternehmen, die eine solche Sequenzierung durchführen – zum Beispiel Plasmidsaurus (www.plasmidsaurus.com) – einen Kreis mit mindestens 2000 bp. Techniken, die auf der Rolling-Circle-Amplifikation basieren, wie die von Octant40 entwickelte, können dies jedoch möglicherweise können Sequenz kurze zirkuläre dsDNA.

Die durch die Restriktionsenzymschnitte erzeugten passenden Überhänge sollen eine hochpräzise Ligation ermöglichen41, was auch durch das Fehlen anderer Überhänge unterstützt wird, die in einer typischen Golden-Gate-Anordnung vorhanden wären (siehe Abb. 1c). Die „nnnnnn“-Sequenzen in Abb. 1c stellen die mindestens sechs Basenpaare dar, die am hinteren Ende des Restriktionsenzyms erforderlich sind. Einige Hersteller (z. B. Twist Bioscience) liefern ihre DNA-Fragmente lieber mit Endadaptern, die als gut konzipierte PCR-Amplifikationsprimer dienen und gleichzeitig den Einbau von Endsequenzen überflüssig machen.

Unser Ziel war es, die Methode der Circular Vector-Produktion benutzerfreundlich und schnell zu gestalten. Daher verwendeten wir hauptsächlich Reaktionsenzyme und Puffer auf Basis kommerzieller Kits und nur wenige zusätzliche Reagenzien. Bei Bedarf können die Kits durch einzelne Reagenzien ersetzt werden. Wenn eine ausreichende Menge an dsDNA von einem kommerziellen Hersteller erhalten wird, kann diese direkt in der Reaktion verwendet werden; andernfalls muss es möglicherweise durch PCR amplifiziert werden, um die gewünschte Menge zu erhalten. Das Protokoll zur Herstellung der zirkularisierten DNA-Vektoren besteht aus drei Schritten:

Schritt 1: Zirkularisierung der Quell-DNA (Abb. 1d). Mischen Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Reaktionsreagenzien durch Pipettieren, vorzugsweise auf Eis, in ein 200-μl-PCR-Röhrchen oder ein anderes geeignetes Röhrchen mit mindestens dem doppelten Reaktionsvolumen der Tabelle 2. Das zusätzliche Volumen wird für die Zugabe der Verdauungsreagenzien in Schritt 2 benötigt. Stellen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und führen Sie die Reaktion wie im Cycler-Zeitplan in Tabelle 2 beschrieben durch.

Schritt 2: Verdau der gesamten verbleibenden linearen DNA (Abb. 1e). Bereiten Sie die T5-Exonuklease-Reaktionsmischung wie in Tabelle 3 aufgeführt vor und mischen Sie sie im Verhältnis 1:1 in das Röhrchen mit der Reaktionsmischung aus dem vorherigen Schritt. Wenn beispielsweise in Schritt 1 eine 50-μl-Reaktion durchgeführt wurde, müssen 50 μl hinzugefügt werden. Programmieren und betreiben Sie den Thermocycler wie im Cycler-Zeitplan in Tabelle 3 aufgeführt.

Schritt 3: Reinigung der zirkularisierten DNA (Abb. 1f). Verwenden Sie ein Spin-Säulen-Kit wie das QIAquick PCR Purification Kit oder Ihre bevorzugte Methode.

Die oben genannten Protokollschritte reichen für eine praktische Anwendung der Methode aus. Eine ausführliche Erläuterung der Schritte und deren Begründung finden Sie im folgenden Abschnitt.

Auf den Restriktionsenzymverdau und die Ligationsreaktion folgt eine 15-minütige Hitzeinaktivierung, um die Ligationsreaktion zu beenden (siehe Abb. 1D). Die konstante Reaktionstemperatur von 37 °C wurde gewählt, um die Fehlpaarungsligation zu minimieren42,43. Die T4-DNA-Ligase wird bei 65 °C inaktiviert. Da das Restriktionsenzym mit einer höheren Inaktivierungstemperatur ausgewählt wurde, bleibt das Restriktionsenzym aktiv und unterstützt den folgenden Verdauungsschritt geringfügig. Es wurde experimentell festgestellt, dass die Konzentrationen von Ligase und Restriktionsenzym bei einer etwas höheren Konzentration besser funktionieren, als es bei der Golden-Gate-Assemblierung üblich ist. Diese höhere Konzentration dient zwei Zwecken: Sie erleichtert die schnelle Verarbeitung und, was noch wichtiger ist, das Restriktionsenzym schneidet schnell freie Überhänge an beiden Enden eines DNA-Fragments und ermöglicht so die Selbstligation dieser Überhänge am selben DNA-Fragment und begrenzt die Anteil mehrerer DNA-Fragmente, die aneinander ligieren (siehe weitere Diskussion im Abschnitt „Ergebnisse“). Die Konzentrationen der zugeführten linearen dsDNA wurden in einem Bereich von 7,5 bis 120 ng/μl getestet und ergaben eine nicht unterscheidbare Ausbeute und Zusammensetzung der zirkularisierten DNA. Eine Konzentration von 120 ng/μl führt zur Zugabe von 6,0 μg DNA pro 50 μl Reaktion, was aus Sicht der Handhabung und der Reagenzienkosten als optimal angesehen wurde. Die Zugabe von ATP kann für eine Ligationsdauer von 1 Stunde optional sein, wobei steigende ATP-Konzentrationen von 1 mM, bereitgestellt durch den NEB T4-DNA-Ligasepuffer, auf 2 mM eine leichte Verbesserung der Ausbeute zeigen, insbesondere bei längeren Ligationsdauern. Dies kann auf die Erschöpfung von ATP bei einer hohen Konzentration ligierter DNA sowie auf die ATP-Inaktivierung bei längerer Reaktionsdauer zurückzuführen sein. Die ATP-Konzentration von 2 mM liegt deutlich im optimalen Bereich für T4-DNA-Ligase-Mischungen44, und das ATP-Reagenz ist kostengünstig. Der Ersatz des Restriktionsenzyms durch ein anderes Typ-IIS-Enzym kann in Fällen erforderlich sein, in denen die für epegRNA kodierende Sequenz die BsaI-Erkennungsstelle enthält (ein Beispiel für die Verwendung von BbsI in einem etwas anderen Szenario finden Sie in der ergänzenden Abbildung 2).

Verdauung nicht zirkularisierter DNA (Abb. 1e). Dieser Schritt besteht aus der Zugabe einer gleichen Menge der T5-DNA-Exonuklease-Reagenzien zur Ligationsreaktion. Beispielsweise werden 50 μl Exonuklease-Reaktionsmix zu 50 μl Ligationsreaktionsausstoß hinzugefügt, was in einem typischen 200-μl-PCR-Röhrchen-Thermocycler von Eppendorf zu einer komfortablen Menge von 100 μl Reaktionsmix führt (größere Röhrchen und Trockenbäder usw. können ebenfalls sein). verwendet werden, falls gewünscht). Die Konzentration der T5-DNA-Exonuklease wurde als ausreichend validiert, um die gesamte lineare DNA für alle in dieser Studie getesteten eingegebenen DNA-Längen in weniger als 1 Stunde vollständig zu verdauen. Wir fanden heraus, dass die alleinige Zugabe von T5-Exonuklease zur Ligationsreaktion aufgrund des Fehlens von Kaliumionen zu einer sehr langsamen Verdauungsrate führte. Die Rolle von NEBuffer 4 besteht darin, Kaliumanionen bereitzustellen, die Exonukleasereaktionen beschleunigen. Während die Kaliumkonzentration in der resultierenden Mischung halb so hoch ist wie die der ausschließlich NEBuffer 4-Reaktionsmischung, bleibt sie nahe der optimalen Konzentration für Spaltungsreaktionen45. Das optimale Gleichgewicht zwischen Exonuklease- und Endonukleaseaktivität für die T5-Exonuklease liegt bei einem Reaktions-pH-Wert von 7,9–8,046. Dies ist der pH-Wert von NEBuffer 4, während der pH-Wert des Ligationspuffers 7,5 beträgt. Daher wurde eine geeignete Menge Tris-Base hinzugefügt, um den pH-Wert auf diesen Bereich zu erhöhen, wie in Tabelle 2 (Hauptartikel) dargestellt. Es wird insbesondere nicht empfohlen, den pH-Wert für die T5-Exonuklease-Reaktionsmischung übermäßig zu erhöhen. Als wir pH-Anstiege über 8,5 testeten, wurde die gesamte DNA – einschließlich der zirkularisierten DNA – vollständig und schnell verdaut.

Reinigung der zirkularisierten DNA. Dieser Schritt umfasst die Verwendung eines hochwertigen DNA-Reinigungskits, um zirkuläre Vektor-DNA mit ausreichender Konzentration und Reinheit zu extrahieren. Wir haben ein Spin-Column-Kit verwendet, das wie unten beschrieben ausgewählt wurde. Da es eine große Anzahl solcher Produkte gibt, liegt die Wahl des Kits im Ermessen des Forschers; Die Ausbeute kann jedoch variieren. Unser Ziel war es, ein einfaches Extraktionskit auf Spin-Säulenbasis auszuwählen, das eine konstant hohe Ausbeute, einen geringen Grad an Verunreinigungen und eine ausreichend hohe DNA-Konzentration für genaue und konsistente Messungen bietet. Diese Reinheit war wichtig für die direkte Verwendung der kreisförmigen Vektoren bei der Zellkulturtransfektion und für die Genauigkeit der in dieser Studie berichteten Konzentrations- und Ertragsmessungen. Eine Reihe von Kits wurde überprüft und drei Kits wurden dann auf ihre Effizienz bei der DNA-Extraktion und bei geringer chaotroper Salzkontamination getestet und bewertet: das Takara Bio NucleoSpin Gel und PCR Cleanup 740609.5047, das QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit 2810648 und NEB Monarch PCR & DNA Reinigungsset T1030S49.

Basierend auf einem Validierungstest mit demselben PCR-Produktsatz wurde das QIAquick-Kit ausgewählt, da es im Vergleich zu den beiden anderen Kits die beste Rückgewinnung von Input-zu-Output-DNA aufweist (20 % besser als NucleoSpin und 30 % besser als NEB). und es wird eine geringe Menge an eingefangenen chaotropen Salzen festgestellt, wenn die Aufreinigung eines leeren PCR-Produkts ohne eingegebene DNA getestet wird. Obwohl das QIAquick-Kit 30 μl als minimales Elutionsvolumen einstuft, bietet es außerdem einen guten Kompromiss aus Ausbeute und höheren DNA-Konzentrationen und zeigt eine ausgezeichnete Reinheit bei der Elution mit Volumina unter 20 μl, was für unsere Validierungsexperimente mit Prime Editing vorzuziehen war . Das QIAquick PCR Purification Kit hat sich als sehr zuverlässig und konsistent erwiesen, wobei in der gesamten Versuchsreihe nur ein Ausreißer mit etwa halb so hoher Ausbeute beobachtet wurde. Dieses Ausreißerergebnis könnte auf einen Defekt in der Spinsäule zurückzuführen sein; Daher wurde die Probe verworfen.

Das QIAquick-Kit enthält einen optionalen pH-Indikator, dessen Zugabe zum Bindungspuffer aufgrund seiner Bedeutung für die Maximierung der DNA-Ausbeute empfohlen wird. Mit dem Indikatorreagenz können wir überprüfen, ob der pH-Wert der Mischung für die Bindung optimal ist. Insbesondere stellten wir fest, dass eine pH-Anpassung durch Zugabe von einem oder mehreren 10 μl 3M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,2 erforderlich war, wie von QIAGEN48 empfohlen.

Besonderes Augenmerk wurde auf die Minimierung von Pipettierverlusten gelegt. Die Menge der zugeführten DNA wurde angepasst, um eine Ausgangsprodukt-DNA im Bereich von 2–4 μg zu ergeben, was eine ausreichende Menge des endgültigen DNA-Produkts für Messungen und Tests bereitstellte. In extremen Fällen musste die Menge der eingegebenen dsDNA für den 1782 bp großen kreisförmigen Vektor auf 27 μg erhöht werden, was immer noch zu einer Ausbeute von nur 1,3–1,7 μg führte, während eine eingegebene DNA-Menge von 6–9 μg in 450 ausreichend war –950-bp-Bereich. Eine solch geringe Ausbeute, die einen hohen DNA-Einsatz und den Einsatz großer Mengen an Reagenzien erfordern würde, um ausreichend Produkt zu produzieren, weist darauf hin, dass die Synthese langer kreisförmiger Vektoren unpraktisch ist. Unser Ziel war es vorzugsweise, eine Konzentration der ausgegebenen DNA von deutlich über 80 ng/μl zu erreichen, was zu hochreiner DNA basierend auf den Verhältnissen 260/230 und 260/280 führen würde. Dies wurde zusätzlich durch die Durchführung eines zusätzlichen Waschschritts bei der Verwendung der Reinigungskits unterstützt, was zu einer konsistent reinen DNA-Ausgabe mit minimalen potenziellen Ertragseinbußen führte. Die DNA-Konzentrationsmessungen wurden hauptsächlich mit einem NanoDrop Eight-Spektrophotometer (ThermoFisher Scientific) durchgeführt und mit einem Spektrophotometer/Fluorometer der DS-11-Serie (DeNovix) wiederholt. Bemerkenswerterweise waren die gemessenen Konzentrationen zwischen diesen beiden Geräten sehr ähnlich.

Die Extraktion von Bande 1 zum Testen der Geneditierungsleistung des reinen einzelnen kreisförmigen Vektors ohne Duplikate wurde durch DNA-Trennung durch Elektrophorese auf 1 % E-Gel EX-Agarose-Gelen (Invitrogen) durchgeführt. Die kreisförmige Vektor-DNA wurde mit dem Monarch DNA Gel Extraction Kit (T1020S) mit einem zusätzlichen Waschschritt gereinigt.

Das maximal mögliche Ausbeuteverhältnis der Zirkularisierungsreaktion wird berechnet, indem die zirkularisierte DNA-Länge geteilt wird, die durch die Schnittstellen des Restriktionsenzyms basierend auf der eingegebenen dsDNA-Länge bestimmt wird. Typischerweise benötigt ein Restriktionsenzym vom Typ IIS sechs Basenpaare oder mehr zwischen ihm und dem Ende des dsDNA-Strangs, um ein effizientes Schneiden zu gewährleisten. Die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms selbst, ein Versatz zwischen der Erkennungsstelle und der Schnittstelle sowie eine Länge des Überhangs werden ebenfalls verworfen. Für unsere Handhabung war es praktisch, die Twist Bioscience-Endadapter beizubehalten, die eine Länge von 22 bp haben und mit Twist Bioscience-Primern für die PCR-Amplifikation dieser DNA-Fragmente verwendet werden können. In diesem Fall ist der maximal mögliche Nenner des Ertragsverhältnisses die Länge der bei Twist Bioscience bestellten dsDNA plus 44 bp. Alle Elemente können formal durch die folgende Gleichung erklärt werden:

Dabei ist R das maximale Ausbeuteverhältnis, Lc die Länge der zirkularisierten DNA, Lenz_site die Erkennungsenzymstelle, Lenz_offset der Versatz zwischen der Enzymerkennungsstelle und dem Beginn des Schnitts, Lcut_length die Länge des Schnitts (typischerweise 4). bp) und Lend_pad sind entweder Füll- oder Endadapter (wie in unserem Fall), vorausgesetzt, dass sie an beiden Enden gleich lang sind. Beispielsweise beträgt das maximal mögliche Ausbeuteverhältnis für von Twist Bioscience gelieferte dsDNA mit Adaptern zur Herstellung eines zirkulären Vektors mit 452 bp 0,88. Wenn also 6 μg DNA als Input verwendet werden, beträgt die maximal mögliche Ausbeute 6 * 0,88 = 5,28 μg.

Wir definieren den molaren Multiplikator des Zirkularisierungsreaktionsprodukts als das Verhältnis des kombinierten relativen Gewichts, das durch die Zirkularisierung erzeugt wird, zum molaren relativen Anteil einer einzelnen kreisförmigen Führung. Wir beurteilen die relativen Bandhelligkeiten anhand des Gelelektrophoresebilds, das mit ImageJ des NIH verarbeitet wurde (siehe ergänzende Abbildung 3 für den vollständigen Satz unmodifizierter Gelelektrophoresebilder). Da wir die relative Helligkeit kennen, müssen wir alle relativen Helligkeiten der Bänder summieren, was per Definition = 1 dividiert durch die Summe der relativen Helligkeiten jedes Bandes (Ii) dividiert durch die Nummer i dieses Bandes ist. Somit wird der Molmultiplikator M berechnet als:

HEK293T-Zellen wurden auf 24-Well-Platten (Corning) mit 140 ⋅ 103 Zellen pro Well in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, ausgesät. Ungefähr 24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen bei 60 % Konfluenz mit 2,0 ml Lipofectamine 2000 in Optimem (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers und 800 ng Cas9-Prime-Editor-Plasmid mit Molverhältnissen von 4:1 (110) transfiziert ng für gereinigte Einzelband-Rundvektoren mit 452 bp, 175 ng für zirkuläre Vektoren mit 452 bp und 370 ng für zirkuläre Vektoren mit 952 bp) für jede der Ortungshilfen (HBB-, CDKL5- und PRNP-Einzelbasensubstitution basierend auf15).

Dann, 14–16 Stunden nach der Transfektion, wurde das Medium durch frisches DMEM plus 10 % FBS und 6 ng/μl Blasticidin (Thermo Fisher Scientific) ersetzt, um Zellen auszuwählen, die Prime Editor enthielten. 24 Stunden später folgten 6 ng/μl. Anschließend wurde nach 24 Stunden ein Medienwechsel durchgeführt (basierend auf einer Empfehlung von Xiong et al.50). Genomische DNA wurde 72 Stunden später mit einem Zymo Research Quick-DNA Microprep Kit (D3020) extrahiert.

Genomische Bereiche von Interesse wurden aus 4 ng DNA des gesamten Genoms unter Verwendung von Q5 High-Fidelity 2× Master Mix (New England BioLabs) in 24–26 Zyklen unter Verwendung des Master-Mix-Protokolls amplifiziert (eine Liste der Primer finden Sie in den Datendateien zur Datenverfügbarkeit). . Anschließend erfolgte die DNA-Trennung durch Elektrophorese auf 1 % E-Gel EX Agarosegelen (Invitrogen) und die Verwendung eines Monarch DNA Gel Extraction Kit (T1020S) mit einem zusätzlichen Waschschritt. Die Sanger-Sequenzierung wurde von Azenta Genewiz unter Verwendung unserer PCR-Primer durchgeführt.

Die geringen Reagenzienkosten des Protokolls werden hier am Beispiel einer typischen 50-μl-Reaktion veranschaulicht. Die Reagenzien werden in den in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Mengen verwendet. Die Herstellerquellen und Identifikatoren sind in Tabelle 4 aufgeführt. Der Großteil der mit Circular Vectors verbundenen Kosten sind die Kosten für lineare dsDNA, die bei einem kommerziellen Lieferanten bestellt wird. Wir stellen die Kosten am Beispiel unseres 452 bp Circular Vector vor. Die Preise, die wir für die Reagenzien zahlten, waren typisch für Einzelhandelskäufer an Universitäten, ohne zusätzliche Rabatte. Mit einer zirkularisierten Länge von 452 bp wurde ein 470 bp großes dsDNA-Fragment bei Twist Bioscience zum Listenpreis von 0,07 $ pro Basenpaar bestellt, was zu Input-DNA-Kosten von 32,90 $ führte.

Normalerweise wurden 1,5–2,0 μg dsDNA-Fragment von Twist Bioscience geliefert. Die Kosten der Reagenzien für ein 50-μl-Protokoll sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt, in den im Abschnitt „Schritt-für-Schritt-Protokoll“ aufgeführten Mengen. Die geplante Ausgabe beträgt 2,0–2,5 μg Circular Vector, was eine Eingabe von 6,0 μg dsDNA erfordert. Diese Ausbeute reicht für mehr als 10 Bearbeitungen auf einer 24-Well-Platte und ~40 Bearbeitungen auf einer 96-Well-Platte. Die Kosten für dieses Circular Vector-Protokoll betragen 9,30 $. Wenn Ihr Lieferant eine ausreichende Menge an DNA-Fragmenten liefern kann, gehen die gesamten Kosten zu Ihren Lasten.

In unserer Studie mussten wir einen PCR-Amplifikationsschritt durchführen (optional, Preise in der Ergänzungstabelle 1), was die Kosten um 4,76 $ erhöhte. Wenn nur eine kleine Menge an zirkulären Vektoren benötigt wird, kann die Reaktion auf eine kleinere Menge verfügbarer DNA verkleinert werden, was zu einem geringeren Reagenzienverbrauch und geringeren Kosten führt.

Alle Protokollreaktionen wurden wie angegeben in unabhängigen Duplikaten (n = 2) oder Dreifachreaktionen (n = 3) durchgeführt und die prozentualen Ausbeutewerte wurden gemittelt. Die Gelelektrophorese der oben genannten Proben wurde mit der ImageJ-Software17 der National Institutes of Health in unabhängigen Probenduplikaten (n = 2) analysiert und die resultierenden Concatemer-Prozentwerte wurden gemittelt.

Die Bearbeitungseffizienzanalyse wurde anhand der Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von EditR22,23 aus unabhängigen Proben in dreifacher Ausführung (n = 3) oder vierfacher Ausführung (n = 4) durchgeführt. Die von EditR berechneten P-Werte für die Bearbeitungseffizienz betrugen für alle Proben P < 5 ⋅ 10−8. Die Bearbeitungseffizienzwerte wurden gemittelt und die entsprechenden Standardabweichungswerte in Tabelle 1 dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Ergänzende Daten 1. Sanger-Sequenzierungsdaten wurden in der GenBank-Datenbank unter den Zugangsnummern abgelegt, die mit OP971846 beginnen und mit OP971880 enden. Unbeschnittene Gelbilder sind in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt.

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Referenzen herunterladen

Abteilung für Genetik, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Roman Theo Olynyk & George M. Church

Institut für Informatik, University of Auckland, Auckland, Neuseeland

Roman Teo Oliynyk

Wyss Institute for Biological Inspired Engineering an der Harvard University, Boston, MA, USA

George M. Kirche

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RO entwarf und führte Forschungsarbeiten durch; RO und GC analysierten die Daten und verfassten die Arbeit.

Korrespondenz mit Roman Theo Oliynyk.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Valentin Zulkower und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Cesar de la Fuente und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Oliynyk, RT, Church, GM Effiziente Modifikation und Vorbereitung zirkulärer DNA für die Expression in Zellkulturen. Commun Biol 5, 1393 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z

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Eingegangen: 15. August 2022

Angenommen: 09. Dezember 2022

Veröffentlicht: 21. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z

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