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Aug 05, 2023

Vaccinia

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1770 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die gerichtete Evolution in bakteriellen oder Hefe-Displaysystemen wurde erfolgreich eingesetzt, um die Stabilität und Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren für strukturelle und biophysikalische Studien zu verbessern. Dennoch können einige Rezeptoren aufgrund ihrer komplexen molekularen Zusammensetzung oder ungünstigen Ligandeneigenschaften in mikrobiellen Systemen nicht angegriffen werden. Hier berichten wir über einen Ansatz zur Entwicklung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Säugetierzellen. Um Klonalität und einheitliche Expression zu erreichen, entwickeln wir ein virales Transduktionssystem auf Basis des Vaccinia-Virus. Durch rationales Design synthetischer DNA-Bibliotheken entwickeln wir zunächst den Neurotensinrezeptor 1 für hohe Stabilität und Expression. Zweitens zeigen wir, dass Rezeptoren mit komplexen molekularen Architekturen und großen Liganden, wie der Parathormon-1-Rezeptor, leicht entwickelt werden können. Wichtig ist, dass funktionelle Rezeptoreigenschaften nun in Gegenwart der Signalumgebung von Säugetieren entwickelt werden können, was zu Rezeptorvarianten führt, die eine erhöhte allosterische Kopplung zwischen der Ligandenbindungsstelle und der G-Protein-Schnittstelle aufweisen. Unser Ansatz liefert somit Einblicke in das komplexe molekulare Zusammenspiel, das für die GPCR-Aktivierung erforderlich ist.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) umfassen die größte Familie integraler Membranproteine ​​und sind an der Regulierung vieler biologischer Prozesse1 beteiligt. GPCRs erfassen auf ihrer extrazellulären Seite eine Vielzahl von Liganden, von kleinen Molekülen bis hin zu großen Proteinen. Um ihre Funktion auszuüben, tasten GPCRs ein Kontinuum von Konformationszuständen ab, was zu Niveaus von keiner bis maximaler Aktivität führt. Liganden stabilisieren bestimmte Konformationen, die den Rezeptor entweder in einem inaktiven Zustand (im Fall von inversen Agonisten) oder im aktiven Zustand (im Fall von Agonisten) halten2. Die durch einen Agonisten an der Ligandenbindungstasche induzierte Konformationsänderung wird auf die intrazelluläre Oberfläche des Rezeptors übertragen und führt zur Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ​​durch Austausch von GDP gegen GTP in der Gα-Untereinheit. Infolgedessen dissoziieren die Gα- und Gβγ-Untereinheiten und können nachgeschaltete Signalprozesse aktivieren3,4. Aufgrund ihrer breiten physiologischen Relevanz sind GPCRs wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel1, und das Verständnis der Struktur-Funktions-Mechanismen, die zur GPCR-Aktivierung führen, ist für die zukünftige Arzneimittelentwicklung von entscheidender Bedeutung. Während Konformationsflexibilität für die ordnungsgemäße Funktion des Rezeptors von entscheidender Bedeutung ist, stellt sie ein Hindernis für die experimentelle Bestimmung von Proteinstrukturen dar. Dies war die Motivation für erhebliche technische Anstrengungen, GPCRs für Strukturstudien zugänglich zu machen.

Wir haben zuvor mehrere Strategien mithilfe der gerichteten Evolution entwickelt, um die biophysikalischen Eigenschaften von GPCRs5,6,7,8 zu verbessern. Ziel der gerichteten Evolution ist es, den Prozess der natürlichen Evolution, also die Anreicherung wünschenswerter Merkmale, die in einem Pool genetischer Varianten kodiert sind, durch iterative Runden der Gendiversifizierung und -selektion zu beschleunigen. Dadurch kann die Proteinfunktion verändert oder neu geschaffen werden, und so ist die gerichtete Evolution zu einer leistungsstarken Methode zur Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge und Therapeutika geworden, die jedoch hauptsächlich auf lösliche Proteine ​​angewendet wird. Um diese Methodik auf GPCRs auszuweiten, wurden mikrobielle Organismen wie Bakterien und Hefen verwendet. Durch Transformation mit Plasmiden können sie im Durchschnitt eine Kopie aufnehmen, so dass jede mikrobielle Zelle nach Festlegung ihrer Kopienzahl immer noch „klonal“ ist. Die Expression von GPCRs in funktioneller Form in der Plasmamembran von Hefe oder der Innenmembran von E. coli wurde gezeigt5,8,9 und somit ist eine strikte Kopplung von Phänotyp und Genotyp gewährleistet, was eine Schlüsselvoraussetzung für die gerichtete Evolution ist. Darüber hinaus können in Mikroben hohe Transformationsraten erreicht werden, um vielfältige Genbibliotheken effizient darzustellen. Mithilfe einer Selektion, die auf der Anzahl der ligandenbindenden und damit funktionellen Rezeptoren in der Membran beruhte, wurde eine Vielzahl gut exprimierender und stabiler GPCR-Varianten erzeugt, die für Strukturstudien und Arzneimittelentwicklungsprojekte von entscheidender Bedeutung waren10,11,12,13,14,15, 16,17.

Während die Handhabungseffizienz und die Generierung von Bibliotheken in Bakterien und Hefen gut geeignet sind, unterliegen mikrobielle Expressionssysteme hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit für Membranproteine ​​einigen grundlegenden Einschränkungen. Die Plasmamembran von Mikroben ist typischerweise durch eine äußere Membran oder Zellwand abgeschirmt, sodass die Ligandenbindungsstelle von Rezeptoren von der extrazellulären Seite aus nicht leicht zugänglich ist, insbesondere für größere Liganden. Es wurden effiziente Permeabilisierungsprotokolle entwickelt, um diese äußeren Barrieren für kleine Moleküle und kurze Peptidliganden durchlässig zu machen5,6,8, doch sperrigere Moleküle wie Peptidhormone oder Proteine ​​erreichen ihre Bindungsstelle am Rezeptor möglicherweise nicht leicht. Außerdem sind viele GPCRs hochtoxisch für Bakterien und Hefezellen, was die Anzahl potenzieller zu entwickelnder Ziele begrenzt, da für die Selektion ein Minimum an Basalexpression erforderlich ist. Schließlich kann die Rezeptorfunktion, d. h. das Potenzial zur Signalübertragung an nachgeschaltete Effektoren, in mikrobiellen Systemen nicht einfach berücksichtigt werden, da endogene Signalkaskaden vollständig fehlen (im Fall von Bakterien) oder nur in sehr eingeschränkter Funktionalität vorhanden sind (im Fall von Hefen). ). Daher beschränkte sich die GPCR-Evolution in mikrobiellen Systemen bisher auf die Verbesserung der Rezeptorexpression und -stabilität, ohne dass sich bisher die Möglichkeit eröffnet hätte, das Potenzial der gerichteten Evolution zur Erforschung funktioneller Aspekte der GPCR-Signalübertragung zu nutzen.

Im Gegensatz dazu gibt es in Säugetierzellen keine derartigen Einschränkungen, und daher können Säugetier-Displaysysteme neue Möglichkeiten für Ligand-Rezeptor-Kombinationen eröffnen. Es war jedoch eine Herausforderung, die einfache Erstellung großer Bibliotheken vom mikrobiellen Displaysystem auf Säugetierzellen zu übertragen. Viele Versuche, Säugetierbibliotheken zu erstellen, stützten sich auf lentivirale Vektoren bei geringen Infektionsmultiplizitäten18. Sie stammen aus dem HIV-Genom und ihr Genom wird in das Wirtsgenom eingefügt. Während dadurch stabile Bibliotheken entstehen würden, weist dieser Ansatz erhebliche Nachteile auf: Die maximale Vielfalt der Bibliotheken ist begrenzt, der Insertionspunkt bestimmt das Expressionsniveau mindestens ebenso stark wie der Phänotyp des Mutanten, das Expressionsniveau ist niedrig wie die Anzahl der Genkopien ist sehr gering und die Identifizierung von Proteinmutanten ist ziemlich mühsam, da DNA nur durch Einzelzell-PCR gewonnen werden kann. Darüber hinaus können eingefügte Transgene auf unvorhersehbare Weise zum Schweigen gebracht werden. Aktuelle Ansätze nutzen die CRISPR/CAS-Technologie oder dedizierte Integrasesysteme, die unabhängig von viralen Vektoren sind, allerdings ist die Bibliotheksgröße derzeit begrenzt19,20,21. Andere Methoden basieren auf einer kontinuierlichen gerichteten Evolution, bei der ein Virusvektor mit niedriger Wiedergabetreue verwendet wird, der während der Virusreplikation eine permanente Mutagenese erzeugt. Dies überwindet zwar die Herausforderung, vielfältige rekombinante Virusbibliotheken zu erstellen, solche Systeme sind jedoch schwer zu kontrollieren und erfordern effiziente Selektionssysteme22,23.

Hier stellen wir ein Säugetierselektionssystem für die gerichtete Evolution von GPCRs vor, das auf einem Vaccinia-Vektor basiert. Es ermöglicht die einfache Generierung äußerst vielfältiger Bibliotheken, die zu einer homogenen Expression von GPCRs führen, was für die anschließende expressionsgesteuerte Selektion unerlässlich ist. Wir verwenden dieses System zur Entwicklung von GPCRs der Klassen A und B und zeigen, dass es in Kombination mit einem rationalen Bibliotheksdesign für umfassende Manipulationen der GPCR-Eigenschaften verwendet werden kann, die von der Erzeugung hochstabilisierter Rezeptorvarianten bis zur Modulation der Signaleigenschaften des Rezeptors reichen.

Monoklonale und homogene Expression des interessierenden Gens sind entscheidende Voraussetzungen für Selektionen in der gerichteten Evolution, die in Säugetierzellen mit gängigen Expressionsstrategien wie der transienten Transfektion nur schwer zu erreichen sind. Um sowohl die gleiche Gendosis als auch die gleiche Klonalität zu erreichen, muss die Zelle ein einzelnes Vektormolekül aufnehmen und es in einer Kopienzahl replizieren, die in allen Zellen ähnlich ist. Daher verwendeten wir ein Vektorsystem, das wir kürzlich entwickelt hatten, um verschiedene cDNA-Bibliotheken im Vaccinia-Virus zu erzeugen24,25. Das Vaccinia-Virus hat ein lineares DNA-Genom von etwa 180 kDa, das im Zytoplasma repliziert und verpackt wird. Daher ist die Genexpression des Vektors zwischen den Zellen homogen und spezifische Rekombinanten können selbst aus einer sehr kleinen Anzahl ausgewählter Zellen leicht gewonnen werden.

Um zu testen, ob mit dem Vaccinia-Vektor eine einheitliche GPCR-Expression erreicht werden kann, haben wir die Expression mehrerer Varianten des Neurotensinrezeptors 1 (NTR1) untersucht. A-431-Zellen wurden mit rekombinantem Virus bei einer MOI von 1 pfu pro Zelle infiziert, wodurch eine durchschnittliche Verteilung von einem Viruspartikel pro Zelle sichergestellt wurde. 16–18 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet und die Rezeptorexpression mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des fluoreszenzmarkierten Liganden NT(8–13) analysiert und mit CHO-Zellen verglichen, die vorübergehend mit denselben Rezeptorkonstrukten transfiziert worden waren. Mit Vaccinia infizierte Zellen zeigten homogene Expressionsniveaus mit enger Verteilung (Abb. 1a). Somit war eine klare Unterscheidung in der Rezeptorexpression zwischen Wildtyp-NTR1 und NTR1-TM86V und NTR1-L5X möglich, zwei Varianten, die zuvor für eine erhöhte funktionelle Expression in E. coli26 entwickelt worden waren. Im Gegensatz dazu führte die Expression der Rezeptorvarianten in vorübergehend transfizierten Zellen zu einer breiten Verteilung der Expressionsniveaus für jedes Konstrukt, was die unterschiedlichen Mengen an Plasmid widerspiegelte, die von den Zellen aufgenommen wurden (Abb. 1a). Daher ermöglicht das Vaccinia-basierte Expressionssystem eine homogene Expression von GPCRs in Säugetierzellen und ermöglicht eine klare Unterscheidung zwischen Varianten mit unterschiedlichen Expressionsniveaus. Um große und vielfältige cDNA-Bibliotheken zu erstellen, die für die gerichtete Evolution erforderlich sind, wurde eine spezifische Rekombinationsstrategie entwickelt, die wir Trimolekulare Rekombination24 nannten. Dabei wird ein gespaltenes Vaccinia-Genom durch ein drittes Fragment ergänzt, das das interessierende Gen zusammen mit einem Selektionsmarker trägt. Erst bei der Rekombination aller drei Fragmente entstehen produktive Viruspartikel. Dadurch liegt der Hintergrund des nicht rekombinanten Virus nahe bei Null, was den Aufbau von Bibliotheken ermöglicht, die Millionen verschiedener Vaccinia-Rekombinanten enthalten24. Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir eine Selektionsplattform für die gerichtete Evolution von GPCRs in Säugetierzellen entwickelt, die von der expressionsgesteuerten Evolution in Bakterien- und Hefezellen5,8 inspiriert ist (Abb. 1b).

ein Vergleich der GPCR-Expression in Plasmid-transfizierten und Vaccinia-transduzierten Säugetierzellen. Vorübergehend transfizierte CHO-Zellen (oberes rechtes Feld), mit Vaccinia-Virus-Konstrukten infizierte A431-Zellen (unteres rechtes Feld). Dargestellt sind Negativkontrolle (grau schattiert), NTR1 (schwarze Linie), NTR1-TM86V (rote Linie) und NTR1-L5X (blaue Linie). b Arbeitsablauf für gerichtete Evolution in Säugetierzellen unter Verwendung des Vaccinia-Virus. Nach der Synthese der GPCR-DNA-Bibliothek wird durch trimolekulare Rekombination24 eine Vaccinia-Virus-Bibliothek erstellt (linker Einschub; gelb, Regionen, die für die Rekombination homolog zum Virus sind; blau, Gen von Interesse). Zu diesem Zweck wird die randomisierte GPCR-DNA-Bibliothek zunächst in ein Vaccinia-Virus-Transferplasmid kloniert. Das GPCR-Gen wird dann mit der verdauten Vaccinia-Virus-DNA rekombiniert und infektiöse Viruspartikel werden mithilfe eines Geflügelpocken-Helfervirus verpackt. Die Virusbibliothek wird verwendet, um A-431-Zellen über Nacht mit einer Infektionsmultiplizität von einem Virus pro Zelle zu infizieren, wodurch die Bibliotheksvielfalt mit einer Redundanz von 5–10 abgedeckt wird. Da die Plasmamembran in Säugetierzellen vom Extrazellulärraum (ECS) aus leicht zugänglich ist, können exprimierte Rezeptoren direkt mit einem fluoreszierenden Liganden Ihrer Wahl markiert werden. Zellen mit höherer Rezeptordichte weisen eine höhere Ligandenbindung und damit eine höhere Fluoreszenz auf und werden dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) sortiert. Nach der Sortierung werden die Zellen mechanisch lysiert, um das Virus freizusetzen, das dann auf frischen Feederzellen vermehrt wird. Der sortierte Virenpool kann dann zur Infektion für nachfolgende Auswahlrunden verwendet werden.

Zunächst wollten wir die Fähigkeiten des Säugetiersystems mit Auswahlen aus früheren Ansätzen der gerichteten Evolution in mikrobiellen Zellen vergleichen. Wir haben uns daher für NTR1 entschieden, da unsere früheren Arbeiten diesen Rezeptor in vier verschiedenen mikrobiellen Selektionssystemen untersucht haben, die alle eine erfolgreiche Selektion sowohl hinsichtlich höherer Stabilität als auch höherer funktioneller Expression von GPCRs gezeigt haben5,6,7,8. Anstatt eine vollständig zufällige Bibliothek durch fehleranfällige PCR zu erstellen, wurde ein halbrationaler Ansatz gewählt, um eine synthetische Bibliothek zu erstellen, in der Position und Art der Mutation leicht kontrolliert werden konnten. Basierend auf der NTR1-Kristallstruktur (PDB-ID: 4BUO)10 wurden Reste für die Randomisierung ausgewählt, die höchstwahrscheinlich an Helix-Helix-Kontakten beteiligt waren, während Reste, die in die Lipidmembranumgebung weisen oder möglicherweise an Liganden- oder G-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, ausgeschlossen wurden . Insgesamt wurden 94 Reste für die Randomisierung ausgewählt. Die Mutagenese war auf einen vordefinierten Satz von Substituenten für jede Position beschränkt, der aus einer phylogenetischen Substitutionsmatrix abgeleitet wurde, die die am häufigsten vorkommenden Aminosäuren für jede Position aus GPCRs der Klasse A enthielt (Ergänzende Abbildung 1, siehe Ergänzende Anmerkungen). Um das Selektionsergebnis mit früheren Kampagnen in mikrobiellen Displaysystemen vergleichbar zu machen, haben wir beschlossen, den Rezeptor von Anfang an von seinen verwandten G-Proteinen zu entkoppeln und so jeden möglichen Einfluss der Rezeptor-G-Protein-Wechselwirkung zu verhindern, der in Säugetierzellen möglich ist, aber nicht in mikrobielle Zellen, auf das Selektionsergebnis. Zu diesem Zweck wurde R1673.50 in der gesamten Bibliothek, die ansonsten auf Wildtyp-rNTR1 basierte, zu Leu mutiert. L1673.50 stört das konservierte D/ERY-Motiv, das für die G-Protein-Kopplung erforderlich ist, und fixiert so den Rezeptor in einem inaktiven Zustand14,27,28,29 (Ergänzende Abbildung 1).

Die resultierende cDNA-Bibliothek enthielt durchschnittlich 2, 9% Mutationen für jede randomisierte Position, was durchschnittlich 2, 8 Mutationen pro Gen ergab (ergänzende Abbildung 1d, e). Aus dieser synthetischen Bibliothek wurde durch trimolekulare Rekombination eine virale Bibliothek erstellt, die eine Diversität von 1,3 × 108 ergab, und A-431-Zellen wurden mit einer MOI von 1 infiziert. Wie bei der vorherigen mikrobiellen Rezeptorentwicklung wurde die Selektion auf der Grundlage des funktionellen Expressionsniveaus durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden rezeptorexprimierende Zellen mit sättigenden Konzentrationen von fluoreszenzmarkiertem NT(8–13) inkubiert und einer FACS unterzogen, wodurch Zellen mit den höchsten Fluoreszenzniveaus (dh der höchsten Rezeptorexpression) angereichert wurden. Nach jeder Sortierrunde wurde das Virus direkt aus den angereicherten Zellpools isoliert, amplifiziert und zur Infektion einer frischen Zellcharge für die nachfolgende Selektionsrunde verwendet (Abb. 1b). Insgesamt wurden zwei Auswahlrunden durchgeführt, indem die obersten 0,5 % bzw. 0,06 % der fluoreszierenden Zellen ausgewählt wurden. Nach jeder Auswahlrunde wurde eine Rechtsverschiebung des Fluoreszenzsignals der sortierten Population beobachtet, was auf ein höheres Rezeptorexpressionsniveau im ausgewählten Pool hinweist (Abb. 2a). Aus jedem Selektionspool wurde NTR1-cDNA durch PCR amplifiziert und in einen Säugetier-Expressionsvektor subkloniert und sequenziert. 94 Klone wurden isoliert und auf Rezeptorexpressionsniveaus untersucht, und die 25 Klone mit der besten Expression wurden weiter analysiert. Insgesamt lagen die Expressionsniveaus zwischen dem 25- und 82-fachen derjenigen von Wildtyp-NTR1 und waren damit ähnlich oder übertrafen sogar die Niveaus, die von durch E. coli entwickelten Mutanten erreicht wurden26. Im Gegensatz dazu zeigte die zugrunde liegende Mutante NTR1-R167L nur einen 2,5-fachen Expressionsgewinn im Vergleich zum Wildtyp-NTR1, was darauf hinweist, dass der Selektionsdruck erfolgreich war und der größte Teil des Expressionsanstiegs während der Selektionen akkumuliert wurde (Abb. 2b, Ergänzungstabelle 1). .

a Sortiertore für verbesserte NTR1-Varianten (linkes Bild). Das Sortiertor für die oberen 0,5 % fluoreszierenden Zellen wird als roter Umriss angezeigt. Histogramm zum Vergleich der Populationen erster und zweiter Sorte nach der Amplifikation im Vergleich zum Wildtyp (rechtes Feld): Sorte 1 (rote Linie), Sorte 2 (blaue Linie), NTR1 (schwarze Linie), Negativkontrolle (dunkelgrau schattiert). b Expressionsanalyse von 25 entwickelten NTR1-Varianten. Die Rezeptorexpression wurde in HEK293T-Zellen durch Durchflusszytometrieanalyse mit sättigenden Konzentrationen von HL488-NT(8–13) bewertet. Die Expressionsniveaus beziehen sich auf die Expression des Wildtyp-Rezeptors und werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten angegeben. c Ligandenaffinitäten von 25 entwickelten NTR1-Varianten. Die IC50-Werte wurden aus Experimenten zur Ligandenkonkurrenzbindung ganzer Zellen mit NT(8–13) abgeleitet. Die Balken stellen die mittlere Änderung ± Standardabweichung der berechneten Affinität (∆pIC50) für jede Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Rezeptor aus drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils in technischen Duplikaten durchgeführt wurden (Ergänzungstabelle 1). d Korrelation zwischen Rezeptorexpression und Thermostabilität. Die Thermostabilität von sieben NTR1-Varianten wurde in Zellmembranfraktionen bewertet und als Änderung der Schmelztemperatur (∆Tm), gemessen durch Ligandenbindung, vom Wildtyp-Rezeptor gegen die Expressionsniveaus von (b) aufgetragen. Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 2–3 unabhängigen Experimenten dar, die in Duplikaten durchgeführt wurden (Ergänzungstabelle 1). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wie bei der R1673.50L-Mutante war die Signalübertragung aller entwickelten NTR1-Varianten, die alle diese Mutation enthielten, stark beeinträchtigt und erreichte mit den besten Mutanten nur 35 % der Wirksamkeit von Wildtyp-NTR1 (Ergänzungsabbildung 2, Ergänzungstabelle 1). . Somit hatte die häufige Mutation R1673.50L einen starken Einfluss auf die Rezeptorfunktion, der durch die Evolution nicht überwunden werden konnte. Die R1673.50L-Mutation allein erhöhte die Affinität für NT(8–13) um das ~3-fache, wohingegen entwickelte Rezeptorvarianten eine bis zu 30-fach erhöhte Agonistenaffinität aufwiesen (Abb. 2c, Ergänzungstabelle 1). Diese offensichtliche Diskrepanz zwischen dem Erreichen einer höheren Affinität ohne direkte Mutationen in der orthosterischen Bindungsstelle und ohne G-Protein-Kopplung wurde auch bei mehreren anderen in E. coli entwickelten NTR1-Varianten und einigen auf andere Weise stabilisierten Rezeptormutanten beobachtet10 ,14,26,30. Dies ist wahrscheinlich eine Folge der Störung der allosterischen Kopplung zwischen der Agonistenbindungsstelle und der intrazellulären G-Protein-Schnittstelle durch Störung des DRY-Mikroschalters und einer Stabilisierung des Rezeptors in einer inaktiven Konformation, obwohl er eine hochaffine Bindung aufweist27,31. Dies wurde durch die Analyse der Thermostabilität mehrerer Klone weiter bestätigt. Alle sieben getesteten Varianten waren stark stabilisiert und ihre Schmelztemperaturen lagen zwischen 4 und 10 ° C über Wildtyp-NTR1, wohingegen die R1673.50L-Mutation allein keinen Einfluss auf die Thermostabilität hatte (Ergänzungstabelle 2). Wie in früheren Evolutionskampagnen in E. coli26 wurde auch hier eine starke positive Korrelation zwischen Expressionsniveaus und Thermostabilität beobachtet (Abb. 2d). Die Sequenzanalyse ergab zwischen 5 und 8 Mutationen pro Variante. Drei Mutations-Hotspots, A1553.38T, Q2395.36T und N3657.49K, waren in 56 %, 96 % bzw. 80 % der Klone vorhanden, was auf einen starken Selektionsdruck auf jeden dieser Reste schließen lässt (ergänzende Abbildung 3). ). A1553.38T und Q2395.36T sind in GPCRs der Klasse A nicht konserviert und es kann kein eindeutiger Zusammenhang mit einer erhöhten Thermostabilität hergestellt werden. Das hochkonservierte N3657.49 ist Teil des NPxxY-Mikroschalters und an die allosterische Natriumstelle von D2.50 in Klasse-A-GPCRs gekoppelt, die beide wichtige Mediatoren für die Signalausbreitung sind. Es wurde gezeigt, dass die Mutation von D2.50 verschiedene GPCRs der Klasse A effektiv stabilisiert8,32, in unserer Auswahl wurde jedoch keine solche Mutation gefunden. Daher wird es interessant sein zu sehen, ob die N3657.49K-Mutation ähnliche strukturelle und stabilisierende Wirkungen hat wie die Störung der Natriumstelle.

Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass in Säugetierzellen in nur zwei Selektionsrunden hochstabilisierte und gut exprimierende Rezeptorvarianten erhalten werden können, die mit den am besten exprimierenden Varianten vergleichbar sind, die durch bakterielle Evolution erhalten wurden. Ähnlich wie bei den Varianten, die aus bakteriellen Selektionen erhalten wurden, bei denen eine G-Protein-Kopplung nicht möglich ist, waren die entwickelten Rezeptoren, die die R1673.50L-Mutation beibehielten, in der G-Protein-Signalisierung stark beeinträchtigt. Dies deutet darauf hin, dass die entwickelten Rezeptoren überwiegend in inaktiven Konformationen stabilisiert wurden, aber dennoch in der Lage sind, eine hochaffine Agonistenbindung zu erreichen, was für die verbesserten biophysikalischen Eigenschaften verantwortlich ist. Es war jedoch keine Sequenzähnlichkeit zwischen den in Säugetierzellen entwickelten NTR1-Varianten und den in E. coli entwickelten Varianten NTR1-TM86V und NTR1-L5X erkennbar. Somit können ähnliche biophysikalische Eigenschaften durch die Auswahl unterschiedlicher struktureller Veränderungen erhalten werden.

GPCRs haben sich so entwickelt, dass sie auf ihrer extrazellulären Seite eine Vielzahl unterschiedlicher Reize wahrnehmen, was sich in einer großen strukturellen Variabilität der extrazellulären Rezeptorregionen widerspiegelt. Einige GPCRs enthalten extrazelluläre Domänen (ECDs), die oft komplexe Faltungen aufweisen, die für die ordnungsgemäße Faltung und Translokation zur Zelloberfläche die komplizierten Qualitätskontrollmechanismen der Säugetierzelle erfordern. Nachdem wir gezeigt haben, dass mit unserem System eine Rezeptorstabilisierung und -expressionsoptimierung in einem Ausmaß erreicht werden kann, das den Ergebnissen mikrobieller Systeme ähnelt oder diese übersteigt, waren wir daran interessiert, ob auch Rezeptoren mit komplexeren Architekturen für die Selektion im Säugetiersystem geeignet wären. Um diese Frage zu beantworten, haben wir uns für den Parathormon-1-Rezeptor (PTH1R) entschieden, der zur Klasse B der GPCRs gehört.

Rezeptoren dieser Klasse unterscheiden sich strukturell von GPCRs der Klasse A durch eine zusätzliche große extrazelluläre Domäne, die für die Bindung von Peptidliganden erforderlich ist. Darüber hinaus erhöhen mehrere posttranslationale Modifikationen des ECD die strukturelle Komplexität der Rezeptorfalte erheblich11,33,34,35, was die Expression in Mikroben behindert. Zuvor gelang es uns, die TMD von PTH1R in Hefe für eine höhere Expression und Stabilität mit einem manipulierten kleinen Peptidliganden zu entwickeln, was eine Voraussetzung für die Aufklärung der Kristallstruktur des Volllängenrezeptors war11. Versuche, PTH1R in voller Länge unter Verwendung des nativen 34-aa-Peptidliganden direkt zu entwickeln, scheiterten jedoch an der toxischen Anreicherung des fehlgefalteten Rezeptors und an der Größe des Liganden, der die Ligandenbindungsstelle in Hefezellen trotzdem nicht erreichen konnte Durchlässigkeit der Zellwand, was die Grenzen mikrobieller Selektionssysteme aufzeigt.

Um die Evolution von PTH1R im Säugetiersystem durchzuführen, wurde eine synthetische Bibliothek erstellt, die einem semirationalen Ansatz folgte, der der oben beschriebenen Bibliothek für NTR1 ähnelt. Die Randomisierung war auf die PTH1R-TMD beschränkt, wodurch Änderungen an der ECD vermieden wurden, die sich möglicherweise auf die Ligandenbindung auswirken würden. Da diese Arbeit vor der Bestimmung der PTH1R-Struktur11 durchgeführt wurde, basierte das Bibliotheksdesign auf einem Strukturhomologiemodell des menschlichen Glucagonrezeptors. Daher wurden 118 Positionen innerhalb der TMD für die Randomisierung ausgewählt, und hier wurden Aminosäuresubstituenten aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeit ausgewählt. Im Gegensatz zur NTR1-Bibliothek wurden jedoch keine festen Mutationen eingeführt, die die Rezeptorfunktion stören würden, da wir untersuchen wollten, ob Rezeptoreigenschaften, die über Expression und Stabilität hinausgehen, auch in Säugetierzellen entwickelt werden können (Ergänzende Abbildung 4, siehe Ergänzende Anmerkungen). . Dennoch wurden der Bibliothek einige Modifikationen hinzugefügt, um die Auswahlergebnisse nachvollziehen zu können. Wir haben 19 Positionen einbezogen, die im Rahmen der Hefe-Evolutionskampagne identifiziert wurden, von denen 7 spezifische Mutationen den Rezeptor in einer inaktiven, äußerst thermostabilen Konformation hielten11. Im Gegensatz zur fixierten R1673.50L-Mutation in der NTR1-Bibliothek war jede der aus Hefe stammenden Positionen vollständig randomisiert, was die Selektion der Wildtyp- oder alternativen Reste an einer solchen Position während der Evolution ermöglichte. Darüber hinaus wurde C351, das eine Disulfidbindung zwischen ECL (extrazellulärer Schleife) 2 und der Spitze der Transmembranhelix 311 bildet, randomisiert, um zu testen, ob eine Störung strukturell relevanter Reste die Auswahl beeinträchtigen würde (ergänzende Abbildung 4C).

Die resultierende cDNA-Bibliothek enthielt durchschnittlich 5,6 % Mutationen für jede randomisierte Position, was zu ~7 Mutationen pro Gen führte (ergänzende Abbildung 4E – F). Aus dieser synthetischen Bibliothek wurde eine virale Bibliothek mit einer Diversität von 1,1 × 108 generiert, und A-431-Zellen wurden mit der Bibliothek bei einer MOI von 1 infiziert. Für die anschließenden Selektionen wurden zwei fluoreszierend markierte Peptidliganden verwendet: erstens die kurzes Peptid M-PTH(1–14), das so konstruiert wurde, dass es nur an die TMD von PTH1R bindet und dennoch die volle agonistische Wirksamkeit des nativen Peptids36 beibehält, und zweitens das PTH-Analogon PTH'(1–34), das diesem ähnelt der native Peptidagonist, da er für eine hochaffine Bindung Wechselwirkungen sowohl mit der ECD als auch mit der TMD des Rezeptors erfordert11,37,38. Insgesamt wurden drei Auswahlrunden mit jedem der fluoreszenzmarkierten Liganden durchgeführt, wobei die obersten 0,2–0,5 % fluoreszierenden Zellen sortiert wurden (ergänzende Abbildung 4G). Auch hier wurde mit zunehmenden Selektionsrunden eine höhere Zellfluoreszenz beobachtet, obwohl nur eine kleine Population stark fluoreszierender Zellen erhalten werden konnte (Abb. 3a). Nach der letzten Runde wurden 92 Klone jeder Ligandenselektion auf Expression untersucht und die am besten exprimierenden 43 Varianten beider Pools wurden weiter analysiert. Wie bei den entwickelten NTR1-Varianten wurde bei allen PTH1R-Varianten ein Anstieg der Expression beobachtet, wenn auch in geringerem Ausmaß (bis zum 9-fachen für PTH1R gegenüber bis zum 85-fachen für NTR1) gegenüber dem Wildtyp (Abb. 3b, Ergänzung). Tisch 3). Allerdings blieben alle PTH1R-Varianten signalaktiv, wobei etwa 50 % der Varianten die maximalen cAMP-Werte überstiegen, die durch Wildtyp-PTH1R-Aktivierung erreicht wurden (Abb. 3c, Ergänzungstabelle 4). Dies steht im Gegensatz zur früheren Entwicklung von PTH1R in Hefe, wo hochstabile, aber signalinaktive Varianten erhalten wurden11. Die Sequenzanalyse der entwickelten PTH1R-Varianten ergab eine recht unterschiedliche Reihe von Mutationen (ergänzende Abbildung 5). Im Gegensatz zu NTR1 wurden keine hochkonservierten Mutationen gefunden und es wurden keine konservierten Motive von GPCRs der Klasse B verändert. Es wurde jedoch festgestellt, dass L3685.44, das mit dem konservierten Val2PTH/PTHrP interagiert, und M4256.57 und T4276.59, die mit dem N-terminalen Rest der PTH-Peptide im aktiven Zustand PTH1R38,39,40 interagieren, in mehr als mutiert sind 25 % der ausgewählten Varianten. Somit könnten diese Mutationen eine mechanistische Begründung für den beobachteten Anstieg der Rezeptorwirksamkeit liefern und weitere Analysen erfordern.

a Vergleich der Populationen nach Selektion mit PTH'(1–34)-HL647 (linkes Feld) oder M-PTH(1–14)-HL647 (rechtes Feld) mit Wildtyp-PTH1R: Sortierung 1 (rote Linie), Sortierung 2 (blaue Linie), Sortierung 3a (schwarze Linie), Sortierung 3b (grüne Linie, Wiederholung von 3a), Negativkontrolle (dunkelgrau schattiert). b Expressionsanalyse von 43 entwickelten PTH1R-Varianten, bewertet in lebenden HEK293T-Zellen durch Durchflusszytometrieanalyse mit sättigenden Konzentrationen von PTH'(1–34)-HL647. Die Expressionsniveaus beziehen sich auf die Expression des Wildtyp-Rezeptors und werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von 2–3 unabhängigen Experimenten angegeben (Ergänzungstabelle 3). c cAMP-Akkumulation von 43 entwickelten PTH1R-Varianten nach Stimulation mit 1 µM PTH(1–34). Die Daten stellen maximale cAMP-Konzentrationen im Verhältnis zu PTH1R dar. Balken stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 3–6 unabhängigen Experimenten dar, die in Duplikaten durchgeführt wurden (Ergänzungstabelle 4). d Ligandenaffinitäten von 43 entwickelten PTH1R-Varianten im Vergleich zu PTH1R. Die IC50-Werte wurden aus Experimenten zur Ligandenkonkurrenzbindung ganzer Zellen mit M-PTH(1–14) oder PTH(1–34) abgeleitet. Die Balken stellen die mittlere Änderung ± Standardabweichung der berechneten Affinität (∆pIC50) für jede Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Rezeptor aus 2–8 unabhängigen Experimenten dar, die in Duplikaten durchgeführt wurden (Ergänzungstabelle 3). Die zur Auswahl verwendeten b–d-Liganden sind unterhalb der Balkendiagramme angegeben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da wir in der vorliegenden Bibliothek die gleichen Mutationen zugelassen hatten wie in der Hefebibliothek, war es interessant zu beobachten, dass diejenigen Mutationen, die zur Rezeptorstabilisierung beitrugen, aber gleichzeitig die Rezeptorsignalisierung störten, im Säugetiersystem deselektiert wurden, und zwar in nahezu allen Fällen An allen Positionen wurde die Wildtyp-Variante bevorzugt (ergänzende Abbildung 6). Daher wurden Mutationen, die für den Erfolg der Stabilisierung einer inaktiven Rezeptorkonformation in Hefezellen entscheidend waren, in einer signalkompetenten Umgebung nicht bevorzugt. Ebenso wurden Mutationen von C351 vollständig zurückgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Bildung des Disulfids zwischen ECL 2 und Helix 3 ein wichtiges Merkmal bei der Selektion ist (ergänzende Abbildung 6), was mit seiner bekannten Relevanz für die Rezeptorfunktion übereinstimmt . Auch hinsichtlich der Ligandenaffinität wurden deutliche Unterschiede zu den zuvor entwickelten NTR1-Varianten beobachtet. Die Bindungsaffinität von PTH(1–34) war für die PTH1R-Varianten größtenteils unverändert oder nur geringfügig (0,6–5-fach) erhöht. Die meisten Rezeptorvarianten zeigten jedoch eine stark erhöhte Affinität für M-PTH(1–14), was auf einen grundlegenden Unterschied in der Bindung beider Liganden hinweist, wobei PTH(1–34) auf seiner Bindung an das ECD beruhen kann (Abb. 3d, Ergänzungstabelle 3). Diese Unterschiede schienen jedoch nicht durch die Art des Liganden während der Selektion hervorgerufen zu werden, da keine Unterschiede in Bezug auf die scheinbaren Rezeptoreigenschaften zwischen Varianten beider Selektionsregime festgestellt wurden. Insgesamt war es in Säugetierzellen möglich, PTH1R in voller Länge mit einem Satz von zwei Liganden unterschiedlicher Größe zu entwickeln, was in mikrobiellen Systemen aufgrund von Einschränkungen durch den Expressionswirt nicht möglich war. Darüber hinaus wurden Rezeptorvarianten erhalten, die signalkompetent blieben, was die Bedeutung des zellulären Kontexts für das Selektionsergebnis zeigt.

Bei NTR1 ermöglicht die Entkopplung der allosterischen Übertragung von der Bindungstasche zur G-Protein-Schnittstelle wahrscheinlich die Akkumulation einer erhöhten Agonistenaffinität, wodurch der Rezeptor in eine Agonisten-bindende, inaktive, aber stabile Konformation gelenkt wird. Dies war bei weiterentwickeltem PTH1R nicht der Fall. Als wir die Thermostabilität von fünf entwickelten Rezeptorvarianten in isolierten Membranfraktionen untersuchten, zeigten alle getesteten Varianten im Vergleich zu Wildtyp-PTH1R eine verringerte Thermostabilität (ergänzende Abbildung 7A, ergänzende Tabelle 5). Angesichts der erhaltenen Signalfähigkeit in Kombination mit einer erhöhten Ligandenaffinität der entwickelten PTH1R-Varianten und der Tatsache, dass die gerichtete Evolution in Säugetierzellen durchgeführt wurde, die G-Proteine ​​exprimierten, spekulierten wir, dass die ausgewählten Mutationen den Rezeptor für diesen Kontext optimiert haben könnten. In Übereinstimmung mit dieser Idee erhöhte sich in Gegenwart von Mini-Gs die Thermostabilität für die meisten Mutanten (ergänzende Abbildung 7B), und für P34_05 war die Abnahme geringer, was zu einer relativen Verbesserung für alle Mutanten führte (ergänzende Abbildung 7C). Dies wurde noch deutlicher, als wir die Bindung verschiedener Liganden in ganzen Zellen verglichen. Wie oben gezeigt, waren die Affinitäten beider Agonisten, M-PTH(1–14) und PTH(1–34), für die PTH1R-Varianten im Vergleich zum Wildtyp-PTH1R erhöht (Abb. 3d, 4a). Allerdings wurde für den partiellen Agonisten PTH(3–34) und stärker ausgeprägt für den inversen Agonisten IA-PTH(7–34) eine Umkehrung der relativen Affinitäten beobachtet, wobei Wildtyp-PTH1R eine etwas höhere scheinbare Affinität aufwies als der weiterentwickelte Varianten (Abb. 4a). Gemäß dem ternären Komplexmodell der GPCR-Signalisierung verschiebt die G-Protein-Assoziation das Konformationsgleichgewicht des Rezeptors in Richtung eines aktiven Zustands, was allosterisch die Agonistenaffinität erhöht und wiederum die Antagonistenaffinität verringert41,42,43. Wir spekulierten daher, dass die entwickelten PTH1R-Varianten möglicherweise Mutationen eingebaut haben, die eine Konformation stabilisieren, die die Bindung von G-Proteinen begünstigt, und so das Rezeptorgleichgewicht in Richtung eines hochaffinen Zustands für Agonisten in Gegenwart von G-Proteinen verschiebt.

a Entwickelte PTH1R-Varianten zeigen eine hochaffine Agonistenbindung, aber eine gleiche oder verringerte Affinität für partielle oder inverse Agonisten in Zellen. Konkurrenzligandenbindungskurven von vollständigem [M-PTH(1–14) und PTH(1–34)], partiellem [PTH(3–34)] und inversem Agonisten [IA-PTH(7–34)], insgesamt gemessen Zellen, die Wildtyp-PTH1R oder 5 entwickelte Varianten exprimieren. b Die hohe Agonistenaffinität der entwickelten PTH1R-Varianten ähnelt der von Wildtyp-PTH1R im G-Protein-gebundenen Zustand. Ligandenbindungskurven von M-PTH(1–14) an entwickelte PTH1Rs wurden in Membranfraktionen gemessen, die aus Zellen erhalten wurden, die PTH1R-Wildtyp oder 5 entwickelte Varianten exprimierten, in Abwesenheit (linkes Feld) oder Vorhandensein (mittleres Feld) von 12,5 µM Mini-Gs. Relative Bindungskonstanten, die durch Konkurrenz der M-PTH(1–14)-Bindung mit markiertem M-PTH(1–14) erhalten wurden, gemessen in ganzen Zellen (aus a) im Vergleich zu Membranfraktionen in Abwesenheit oder Anwesenheit von 12,5 µM Mini-Gs (rechtes Feld). Positive Werte spiegeln somit eine stärkere Bindung an Membranfraktionen als an Zellen wider. c Erhöhte Agonistenaffinität ist G-Protein-abhängig. Die Bindung von 40 nM M-PTH(1–14) wurde in Membranfraktionen gemessen, die mit zunehmenden Konzentrationen von Mini-Gs ergänzt waren. Die Daten beziehen sich auf die Bindungsniveaus von PTH1R in Abwesenheit von Mini-Gs (grauer Bereich). Linkes Feld: Varianten, die einen erhöhten basalen und G-Protein-abhängigen Anstieg der Ligandenbindung zeigen. EC50-Werte werden als gepunktete vertikale Linien angezeigt (PTH1R: 1,39 ± 0,2 µM, P34_05: 0,28 ± 0,06 µM, P34_13: 0,38 ± 0,1 µM). Rechtes Feld: Varianten, die einen Anstieg der Ligandenbindung unabhängig vom G-Protein zeigen. Der vom G-Protein unabhängige Anstieg der Ligandenbindung ist auf eine höhere Grundaktivität zurückzuführen. Die cAMP-Spiegel wurden 30 Minuten nach Zugabe des Phosphodiesterase-Inhibitors IBMX zu Zellen, die PTH1R-Varianten exprimierten, gemessen und auf die Rezeptorexpressionsniveaus normalisiert. Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 3 Experimenten dar, die in Duplikaten durchgeführt wurden. **p = 0,0044, ****p < 0,0001. Die statistische Signifikanz wurde durch einfaktorielle ANOVA und Bonferroni-Mehrfachvergleich bestimmt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um diese Hypothese zu testen, haben wir die Wirkung von G-Protein auf die Ligandenbindung direkt verglichen. Die Affinität von M-PTH(1–14) zu Wildtyp-PTH1R in isolierten Membranfraktionen war im Vergleich zu seiner Affinität in ganzen Zellen um das Fünffache erhöht, was wahrscheinlich die Bildung eines stabileren Rezeptor-G-Proteinkomplexes aufgrund niedrigerer Nukleotidkonzentrationen widerspiegelt in Membranfraktionen42. Im Gegensatz dazu blieben die Agonistenaffinitäten der entwickelten Varianten identisch mit ihren Affinitäten in ganzen Zellen. Lediglich für die Variante P34_13 wurde eine Abnahme der Affinität gegenüber Wildtyp-PTH1R durch den Übergang von den Zellen zu den Membranen beobachtet. Durch die Zugabe von Mini-Gs zu den Membranfraktionen, die den aktivierten Zustand des G-Proteins nachahmen44, wurde die Affinität von Wildtyp-PTH1R weiter in Richtung der der entwickelten Varianten verschoben, was darauf hindeutet, dass der Hochaffinitätszustand der entwickelten Varianten tatsächlich darauf zurückzuführen ist höhere Neigung, eine Konformation im aktiven Zustand anzunehmen (Abb. 4b).

Um diese Ergebnisse zu untermauern, haben wir den Einfluss des G-Proteins auf die Induktion eines hochaffinen Zustands für jede der Varianten weiter untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Rezeptorbelegung durch M-PTH(1–14) bei submaximalen Konzentrationen als Funktion steigender G-Protein-Konzentrationen gemessen (Abb. 4c). Bei allen entwickelten Rezeptorvarianten, die bereits ohne extern hinzugefügtes G-Protein auskamen, war im Vergleich zum Wildtyp-PTH1R ein größerer Anteil des Rezeptors ligandengebunden, was den offensichtlichen Hochaffinitätszustand widerspiegelt, der in den Konkurrenzbindungskurven beobachtet wurde. Wie erwartet verschob sich mit steigender G-Protein-Konzentration die fraktionierte Bindung von M-PTH(1–14) an Wildtyp-PTH1R um das Zweifache, was auf den durch G-Protein induzierten Übergang des Rezeptors in einen hochaffinen Zustand hinweist Bindung. Die Varianten P34_05 und P34_13 zeigten ein ähnliches Verhalten, da beide Varianten mit steigenden zugesetzten G-Protein-Konzentrationen in einen hochaffinen Zustand verschoben wurden. Allerdings deuteten 4–5-fach niedrigere EC50-Werte darauf hin, dass beide Rezeptorvarianten eine höhere Affinität für G-Protein aufwiesen und somit den Zustand hoher Affinität leichter erreichten. Im Gegensatz dazu befanden sich die Varianten P34_06, P34_07 und P14_12 bereits in einem hochaffinen Zustand, der unabhängig vom hinzugefügten G-Protein war. Ebenso zeigten die letztgenannten Varianten eine erhöhte Basalrezeptoraktivität, wohingegen die Basalaktivität der Varianten P34_05 und P34_13 der von Wildtyp-PTH1R ähnelte (Abb. 4d). Daher hat die Entwicklung von PTH1R mit einem Agonisten in einer signalkompetenten Umgebung zur Anhäufung von Mutationen geführt, die den Übergang des Rezeptors in einen aktiven G-Protein-gebundenen Zustand begünstigen oder die die basale Rezeptorsignalisierung in einer mit der Agonistenbindung kompatiblen Konformation fördern. was beide zu einer höheren scheinbaren Affinität für Agonisten führt.

Für die gezielte Evolution von GPCRs werden bakterielle und Hefe-Selektionssysteme eingesetzt, da große Bibliotheken erstellt werden können, in denen jede Zelle eine einzelne Rezeptorvariante trägt. Die hohe Transformationseffizienz und die Etablierung einer ziemlich einheitlichen Plasmidkopienzahl stellen sicher, dass die Verknüpfung zwischen Genotyp und Phänotyp erhalten bleibt und beide leicht bestimmt werden können. Allerdings ist die Anwendbarkeit mikrobieller Systeme aufgrund der äußeren Barriere einer Zellwand oder einer äußeren Membran auf relativ kleine Liganden beschränkt, die für die Selektion verwendet werden können. Da außerdem zu Beginn des Selektionsprozesses eine minimale Expression des nativen Rezeptors erforderlich ist, kann die Toxizität einiger Rezeptoren ein Problem darstellen.

Hier demonstrieren wir die Entwicklung eines Systems, das keine derartigen Einschränkungen aufweist. Säugetierzellen bieten eine native zelluläre Umgebung für GPCRs, einschließlich Qualitätskontrolle beim Export, Membranzusammensetzung und posttranslationaler Modifikationsmaschinerie, was zu optimalen Expressionsbedingungen selbst für komplexe Rezeptoren führt. Gleichzeitig ist die Ligandenbindungstasche an der Zelloberfläche für Liganden jeder Größe und Zusammensetzung leicht zugänglich. Sogar konformationsspezifische Modulatoren, die an die extrazelluläre Oberfläche binden, wie etwa Antikörperfragmente, könnten als Selektionswerkzeuge verwendet werden. Darüber hinaus sind GPCRs in Säugetierzellen in das endogene zelluläre Signalgerüst integriert. Dies bietet die Möglichkeit, sogar Signalwege abzufragen und so gezielt auf bestimmte Signaleigenschaften zu selektieren.

Die Erstellung klonaler Bibliotheken in Säugetierzellen ist jedoch schwierig. Standard-Transfektionsmethoden sind nicht geeignet, da sie relativ ineffizient sind und typischerweise mehrere hundert Plasmide – mit einer beträchtlichen Ausbreitung von Zelle zu Zelle – von jeder Zelle aufgenommen werden, was eine Kopplung von Genotyp und Phänotyp in keiner Weise ausschließt. Der Schlüssel zu unserer Entwicklung war die Nutzung eines hocheffizienten Virustransduktionssystems, das auf einem Vaccinia-Vektor24 basiert. Es kombiniert die Möglichkeit, die Transduktionsrate auf einen Durchschnitt von einem Partikel pro Zelle einzustellen und so die Monoklonalität aufrechtzuerhalten, gekoppelt mit einer inhärenten Vektoramplifikation, die ziemlich gleichmäßige Kopienzahlen erreicht. Ein weiteres Merkmal ist ein einzigartiges Rekombinationsmodul im viralen Vektor, das die Erstellung hochdiverser Bibliotheken ermöglicht, die auch für große Proteine ​​wie GPCRs kompatibel sind.

Während üblicherweise Zufallsmutagenese zur Generierung genetischer Diversität eingesetzt wird, haben wir stattdessen synthetische GPCR-Bibliotheken durch Codon-basierte Festphasensynthese45,46 erstellt, die eine vollständige Kontrolle über Position und Zusammensetzung der Randomisierung ermöglicht und außerdem Frameshifts und Stoppcodons vermeidet. Somit können vorherige strukturelle und funktionelle Kenntnisse in das Design einbezogen werden, um die Selektionsergebnisse zu verbessern, unerwünschte Selektionsereignisse von vornherein auszuschließen und vordefinierte Verzerrungen in die Bibliothek einzuführen, z. B. für Aminosäuretypen oder einen Prozentsatz von Wildtyp-Codons. Darüber hinaus haben wir hier diesen Ansatz verwendet, um die Genauigkeit des Selektionssystems zu testen, indem wir die Bibliotheken mit spezifischen Mutationen mit vorhersehbaren Auswirkungen versetzten. Für NTR1 diente die Kristallstruktur10 als Vorlage zur Identifizierung geeigneter Reste für die Randomisierung, und wir beschränkten die Mutagenese auf die häufigsten entsprechenden Aminosäuren aller Klasse-A-GPCRs, um so einen evolutionären Kontext aufrechtzuerhalten und potenziell schädliche Mutationen auszuschließen. Für PTH1R haben wir die Bibliothek auf der Grundlage eines Strukturhomologiemodells und chemisch konservativer Mutagenese entworfen, da zu diesem Zeitpunkt weder Strukturinformationen noch ausreichende phylogenetische Daten für PTH1R verfügbar waren. Dies zeigt, dass auch ohne genaue Strukturinformationen leistungsstarke Bibliotheken generiert werden können. Aus der stetig wachsenden Menge an strukturellen und funktionalen Informationen zu GPCRs, die problemlos in den Arbeitsablauf integriert werden können, können in Zukunft noch anspruchsvollere Bibliotheksdesigns abgeleitet werden.

Unser erstes Ziel bestand darin, mikrobielle Selektionen, also die Rezeptorentwicklung in Abwesenheit jeglicher nachgeschalteter Effektoren wie G-Proteine, zu rekapitulieren, um die Genauigkeit dieses Säugetiersystems mit früheren Ansätzen zu vergleichen. Daher wurde die Bibliothek für NTR1 so konzipiert, dass sie die Mutation R1673.50L enthält, die das DRY-Motiv im Rezeptorkern stört, das für die G-Protein-Kopplung erforderlich ist14,27,28,29. Bemerkenswert ist, dass die R1673.50L-Mutation selbst zwar keinen Einfluss auf die Stabilität und im Vergleich zum Wildtyp-NTR1 nur einen mäßigen Einfluss auf die Expressionsniveaus hatte, aber die Entkopplung des Rezeptors vom G-Protein ermöglichte, was zur Anhäufung von Mutationen während der Mutation führte Selektion, die gleichzeitig die Expressionsniveaus und die Thermostabilität stark erhöhte (Abb. 5). Mehrere Varianten übertrafen sogar die Expressionsniveaus von Rezeptoren, die in E. coli eine umfassende expressionsgesteuerte Evolution durchlaufen hatten26. Außerdem zeigten alle entwickelten Varianten im Einklang mit früheren Selektionen in mikrobiellen Systemen eine erhöhte Agonistenaffinität, obwohl sie nicht in der Lage waren, G-Proteine ​​zu aktivieren. Wichtig ist, dass diese Tatsache die Auswahl hinsichtlich der gewünschten Merkmale, einer höheren funktionellen Expression und Proteinstabilität nicht ausschloss. Wie in Strukturen zuvor stabilisierter Rezeptoren beobachtet10,14, könnte dies darauf hindeuten, dass die Entkopplung des Signalübertragungswegs zwei Konsequenzen für das Selektionsergebnis hatte: Erstens wurden Mutationen angereichert, die den extrazellulären Teil des Rezeptors entsprechend der Agonistenbindung versteiften, mit der Konsequenz von Förderung der hochaffinen Agonistenbindung, was wiederum zur Rezeptorstabilität beiträgt. Zweitens wurde der intrazelluläre Teil des Rezeptors durch Mutationen stabilisiert, die den Rezeptor in einer inaktiven Konformation hielten, was durch die Anwesenheit von R1673.50L begünstigt wurde (Abb. 5). Kurz gesagt kann man davon ausgehen, dass sich die beiden Teile des Rezeptors unabhängig voneinander entwickelt haben.

GPCRs erfassen eine Vielzahl von Konformationszuständen, die durch Liganden- und G-Protein-Bindung allosterisch moduliert werden. Die Einführung einer Entkopplungsmutation (roter Stern) führt zu einer Störung der Signalübertragung von der Ligandenbindungstasche zur G-Protein-Schnittstelle (linker Pfad). Daher wurden bei der anschließenden gerichteten Evolution in Abwesenheit von G-Protein oder wenn seine Bindung durch eine Mutation verhindert wurde, die bereits den inaktiven Zustand stabilisierte, bevorzugt Mutationen ausgewählt, die den Rezeptor in einem inaktiven Zustand (grau) weiter stabilisierten, was zu einem starren und stabilen Zustand führte Konformation. Wenn die Rezeptorfunktion zu Beginn der Selektion erhalten bleibt, bestimmt die zelluläre Umgebung, die G-Proteine ​​enthält, das Selektionsergebnis. Es wurden Mutationen ausgewählt, die die allosterische Kopplung zwischen der Agonisten-besetzten Konformation der Ligandenbindungstasche und der Aktivzustands-(AS)-Konformation der G-Protein-Bindungsschnittstelle (blau) fördern. In einigen Fällen wurden Mutationen angereichert, die eine starke allosterische Kopplung der Konformation im aktiven Zustand fördern, was zu einer konstitutiven Rezeptoraktivität führt (grün). Abbildung modifiziert nach Nygaard et al.60.

Im Gegensatz dazu enthielt die PTH1R-Bibliothek keine festen Mutationen, von denen man erwarten würde, dass sie die nachgeschaltete Signalübertragung stören würden. Dadurch waren endogene G-Proteine ​​prinzipiell in der Lage, mit dem Rezeptor zu interagieren und das Selektionsergebnis zu beeinflussen. Tatsächlich wurden Mutationen, die absichtlich in die Bibliothek aufgenommen wurden und den Rezeptor auf Kosten einer verringerten Signalkapazität stabilisieren würden, unter diesen Selektionsbedingungen nicht gefunden. Im Einklang mit diesem Befund zeigten ausgewählte Rezeptorvarianten im Vergleich zu Wildtyp-PTH1R in Membranpräparaten ohne G-Proteine ​​eine noch geringere Thermostabilität, was darauf hindeutet, dass ein grundlegend anderer Selektionsweg verfolgt wurde. Die erwartete erhöhte Stabilität wurde beobachtet, sobald G-Protein zu den Membranen hinzugefügt wurde.

Wie bei NTR1 wurde für die meisten Varianten ein allgemeiner Anstieg der Rezeptorexpression und der Ligandenaffinität beobachtet, unabhängig vom Peptidagonisten, der zur Selektion verwendet wurde. Der Anstieg der Ligandenaffinität war für M-PTH(1–14) ausgeprägter als für natives PTH(1–34). In Anbetracht der Tatsache, dass Mutationen auf die TMD beschränkt waren und M-PTH(1–14) keine zusätzlichen Kontakte zur ECD herstellt, konnte man vernünftigerweise annehmen, dass Veränderungen innerhalb der TMD für eine erhöhte Ligandenaffinität verantwortlich waren. Die weniger ausgeprägten Unterschiede in der PTH(1–34)-Affinität können durch die zusätzliche Energie erklärt werden, die durch Wechselwirkungen des C-terminalen Teils der Peptidbindung mit dem ECD in GPCRs der Klasse B bereitgestellt wird47.

Interessanterweise war der offensichtliche Anstieg der Agonistenaffinität für die entwickelten PTH1R-Varianten in ganzen Zellen am deutlichsten. Die Bindung eines Agonisten an einen GPCR verschiebt sein Konformationsgleichgewicht in einen Zustand, der die Interaktion mit G-Proteinen begünstigt48,49 und somit zur Aktivierung des G-Proteins durch Destabilisierung der Nukleotidbindungstasche und GDP-Dissoziation führt50. Der resultierende nukleotidfreie ternäre Komplex weist häufig eine erhöhte Agonistenbindungsaffinität auf41, ist jedoch in vivo aufgrund hoher intrazellulärer GTP-Konzentrationen extrem kurzlebig, was zu einer schnellen Bindung von GTP an Gα51 führt. In Membranfraktionen, die im Vergleich zu ganzen Zellen nukleotidarm sind, wurde ein relativer Anstieg der Agonistenaffinität von Wildtyp-PTHR beobachtet, was die höhere Stabilität ternärer Komplexe in Abwesenheit von Nukleotiden widerspiegelt. Dies war noch deutlicher, wenn Membranfraktionen mit Mini-Gs ergänzt wurden, wodurch der nukleotidfreie Zustand von Gα nachgeahmt wurde. Unter diesen Bedingungen zeigte der Wildtyp-Rezeptor eine Agonistenaffinität, die mit der der entwickelten Varianten vergleichbar war.

So wurden bei der Selektion von PTH1R Mutationen erworben, die es dem Rezeptor ermöglichen, auch ohne die Hilfe einer G-Protein-Konformation im aktiven Zustand in einen hochaffinen Zustand überzugehen. Daher wird die allosterische Kopplung der Ligandenbindungsstelle mit der aktiven, aber nicht mit der inaktiven Konformation der G-Protein-Bindungsstelle durch die ausgewählten Mutationen verstärkt, was gleichzeitig zu einer höheren Agonisten- und G-Protein-Affinität in vielen der ausgewählten Mutanten führt31 (Abb. 5). ). Im Einklang mit diesem Befund war die scheinbare Affinität zu Mini-Gs für zwei der entwickelten Varianten erhöht. Bemerkenswert ist, dass wir bei drei Varianten keinen zusätzlichen Einfluss von Mini-Gs auf die Agonistenbelegung des Rezeptors beobachten konnten. Interessanterweise zeigten diese drei Varianten eine erhöhte konstitutive Rezeptoraktivität, was erklärt, warum der Zustand der hohen Affinität des Rezeptors durch die Zugabe von G-Protein nicht weiter verändert wird.

In der vorliegenden Studie verwendeten wir die Ligandenbindung als Ersatz für die Expression eines korrekt gefalteten und integrierten Rezeptors und als primären Selektionsdruck. Während dies zu expressions- und stabilitätsoptimierten Rezeptorvarianten für NTR1 geführt hat, war dies bei PTH1R bei der Messung wie bei NTR1 nicht der Fall. PTH1R konnte sich in einer voll funktionsfähigen Signalumgebung entwickeln, und wir beobachteten, dass die Selektion stark von der Rezeptorfunktion beeinflusst wurde. Selbst ohne einen direkten Selektionsdruck auf die G-Protein-Bindung auszuüben, erhielten wir Rezeptorvarianten, die zwar eine höhere Stabilität erreichten, jedoch nur, wenn man sie an ein G-Protein anbinden durfte. Doch anders als bei der NTR1-Selektion war es bei der PTH1R-Selektion schwieriger, den Zellpool mit hohen Fluoreszenzwerten aufrechtzuerhalten. Wir können nicht ausschließen, dass unter dem Stress der FACS-Selektion mit einem viralen Vektor mit hoher Kopienzahl einige stark exprimierende Klone verloren gehen, während andere kompatibel sind. Darüber hinaus können Varianten mit hoher konstitutiver Aktivität im Verlauf der Selektion aufgrund der ständigen Internalisierung verloren gegangen sein, wodurch der Rezeptor für den fluoreszierenden Liganden unzugänglich wird und möglicherweise auch die Lebensfähigkeit der Zelle aufgrund der hohen Basalsignalisierung beeinträchtigt wird.

Insgesamt hat uns dieses Säugetierselektionssystem die Auswahl von Rezeptoren mit stark veränderten funktionellen Eigenschaften ermöglicht, die wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der Mechanismen der Signalübertragung in dieser Rezeptorklasse sein werden. Die stabilisierten Rezeptoren können bei der fragmentbasierten Arzneimittelentdeckung nützlich sein, wo die anfänglich niedrigen Potenzen funktionelle Tests ausschließen und die Trefferfindung auf Bindungstests beruhen muss, z. B. durch NMR und SPR16 an solubilisierten Rezeptoren. Mutanten mit hoher konstitutiver Aktivität könnten besonders interessante Kandidaten für Wirkstoff-Screening-Ansätze sein52. Wie oben erwähnt, könnten einige dieser Mutanten mit dem aktuellen Setup übersehen werden. Ein Ausweg könnte jedoch darin bestehen, andere Auswahlparameter zu verwenden, die die Downstream-Signalisierung direkt messen. In den letzten Jahren ist eine Vielzahl von Sensorsystemen zur Untersuchung der GPCR-Funktion auf allen Ebenen der Signalkaskade in Säugetierzellen verfügbar geworden. Viele dieser Tests basieren auf Fluoreszenz und sind grundsätzlich mit Durchflusszytometrie-Anwendungen kompatibel. Solche Tests umfassen Rezeptor-G-Protein-, Rezeptor-Arrestin- oder sogar G-Protein-Interaktionstests, die auf geteilten Fluorophorsystemen oder FRET-Sensoren basieren53,54,55,56,57. Die Integration solcher Sensoren zur Rezeptorauswahl wird die Vielseitigkeit unseres Evolutionssystems bei Säugetieren weiter erhöhen, da die Rezeptorentwicklung auf bestimmte funktionelle Eigenschaften ausgerichtet werden kann. Diese Strategie sollte sich als besonders nützlich für die Entschlüsselung der Mechanismen der Signalverzerrung und der Regulierungsmechanismen der GPCR-vermittelten Signaltransduktion erweisen. Darüber hinaus ermöglicht es die Umnutzung von Membranrezeptoren als Biosensoren für Arzneimittel-Screening-Anwendungen und könnte zur Entwicklung von Werkzeugen für optogenetische Anwendungen genutzt werden.

Menschliches PTH(1–34) und PTH(3–34) stammten von Bachem. Neurotensin 8–13 [NT(8–13)] stammte von Anaspec. Menschliches [Ac5c1, Aib3, Q10, Har11, A12, W14]PTH(1–14), [M-PTH(1–14)] wurde von Peptide Specialty Laboratories synthetisiert. M-PTH(1–14) wurde an K13 mit HiLyte-Farbstoff 647 [M-PTH(1–14)-HL647] markiert. [Nle8,18,Y34,C35]PTH(1–34) wurde an C35 mit HiLyte-Farbstoff 647 markiert [PTH'(1–34)-HL647, wobei der Strich die Sequenzänderungen im Vergleich zu PTH(1–34) anzeigt]. Neurotensin 8–13 wurde an der N-terminalen Aminogruppe mit HiLyte-647 [HL647-NT(8–13)] oder HiLyte-488 [HL488-NT(8–13)] fluoreszierend markiert. Alle fluoreszenzmarkierten Peptide wurden von Anaspec individuell synthetisiert.

HEK293T-Zellen (Kat.-Nr. CRL-11268), A-431-Zellen (Kat.-Nr. CRL-1555) und BS-C-1-Zellen (Kat.-Nr. CCL-26) stammten von ATCC und wurden in Dulbeccos modifiziertem Medium kultiviert ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Kälberserum. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % CO2 und 95 % Luft gehalten. Die vorübergehende Transfektion von HEK293T-Zellen wurde mit TransIT-293 (Mirus)-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. CHO-S-Zellen (Life Technologies, Kat.-Nr. R80007) wurden als Schüttelsuspensionskultur unter Verwendung von Power CHO 2CD-Medium (Lonza), ergänzt mit 8 mM L-Glutamin, 0,1 mM Hypoxanthin und 0,1 mM Thymidin, gehalten. Die Zellen wurden über Nacht in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum ausgesät, um die Adhäsion vor der Transfektion zu erleichtern. Die vorübergehende Transfektion wurde mit Lipofectamin-Reagenz (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

cDNA-Bibliotheken für Ratten-NTR1 und humanes PTH1R wurden von der MorphoSys AG als lineare DNA-Fragmente mithilfe der Slonomics®-Technologie26,45,46 individuell synthetisiert. Konstante Teile der Sequenz wurden aus einem Wildtyp-haltigen Plasmid amplifiziert. Um die variablen Teile zu erzeugen, wurden Mischungen von Ankermolekülen in einem definierten Verhältnis erzeugt, um alle Kombinationen zweier benachbarter Positionen innerhalb einer variablen Region darzustellen26,45,46. Diese Mischungen wurden durch Ligation mit der wachsenden DNA-Kette verbunden. Das Reaktionsprodukt wurde durch Immobilisierung auf einer mit Streptavidin beschichteten Oberfläche (Microcoat) gereinigt. Anschließend wurden durch Restriktion mit dem Enzym Eam1104I (Thermo Scientific) neue Überhänge für den nächsten Reaktionszyklus erzeugt und eine neue Mischung aus Ankermolekülen hinzugefügt. Nach drei bis sieben Reaktionszyklen wurden die Produktpaare kombiniert, um Transpositionszwischenprodukte zu erzeugen. Diese wurden entweder in einer zweiten Runde zu langen variablen Regionen kombiniert oder durch Restriktion und Ligation mit konstanten Teilen zusammengesetzt. Längenvarianten wurden separat synthetisiert, durch PAGE quantifiziert, in einem definierten Verhältnis gemischt und zu einem Pool zusammengesetzt. Die PTH1R-Bibliothek wurde getrennt in zwei gleich großen Fragmenten synthetisiert und durch Restriktion mit Esp3I (Thermo Scientific) in der flankierenden Region und anschließende Ligation kombiniert. Das endgültige Ligationsprodukt wurde durch PCR unter Verwendung von Phusion DNA-Polymerase (NEB) auf ~2 μg amplifiziert.

Akzeptorkonstrukte für Ratten-NTR1, die eine Klonierungskassette mit der Mus musculus IgG-Signalsequenz aa 1–17 enthalten, wurden sowohl für das Säugetier-Expressionsplasmid (EFMOD, Vaccinex, 5'-BssHII- und 3'-SalI-Klonierungsstellen) als auch für das Vaccinia-Transferplasmid ( VHEH5-, Vaccinex-, 5'-BssHII- und 3'-BsiWI-Klonierungsstellen). Das Wildtyp-Ratten-NTR1-Gen (Aminosäuren 43–424) wurde zusammen mit den NTR1-Varianten L5X und TM86V mithilfe von PCR (iProof High-Fidelity-DNA-Polymerase, BioRad) und den folgenden Primern amplifiziert: NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3 ' und NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCCGGGTG-3' (für EFMOD) oder NTRAddBsiW1stop-5'-tttttCGTACGtTCAGTACAGGGTCTC- 3' (für VHEH5) durch Standardprotokolle. Anschließend wurden PCR-Produkte in die Expressions- und Transferplasmide kloniert. Der Aufbau der DNA-Bibliothek wurde durch PCR (Advantage2-Polymerase, Clontech) der Mutantenbibliothek 2218_−1_LIB_rNTR1 (43–424) unter Verwendung derselben Primer durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde auf 1 % Agarose/TBE-Gelen aufgetrennt. Die 1177-bp-Bande wurde gelgereinigt (Qiaquick, Qiagen), verdaut und unter Verwendung von NxGenT4-DNA-Ligase (Lucigen) in das VHEH5-Plasmid ligiert. Die hocheffiziente Transformation erfolgte durch Elektroporation von NEB10Beta-E.-coli-Zellen (BioRad GenePulser, 1-mm-Küvette, 2,0 kV, 200 Ω, 25 µF), um eine Plasmidbibliothek mit einer Diversität von ~1,4 × 107 zu erstellen.

Akzeptorkonstrukte für menschliches PTH1R mit einer Klonierungskassette, die die PTH1R-Signalsequenz aa 1–23 (einschließlich einer natürlich vorkommenden BsiWI-Stelle) und eine 3'-SalI-Stelle enthält, wurden sowohl für die Säugetierexpression (EFMOD, Vaccinex) als auch für das induzierbare Vaccinia-Transferplasmid konstruiert ( T7terVHE, Vaccinex). Das menschliche Wildtyp-PTH1R-Gen in voller Länge (1–593) wurde mittels PCR (Q5-DNA-Polymerase, NEB) amplifiziert und in Expressions- und Transferplasmide (BsiWI/Sall) kloniert. Der Aufbau der DNA-Bibliothek wurde durch PCR (Q5 DNA Polymerase, NEB) der linearen DNA der Mutantenbibliothek SLN2248 unter Standardbedingungen und minimalem Zyklus unter Verwendung der folgenden Primer durchgeführt: PTH1Rsignalsense 5-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' und PTH1R AS 5'-TGTCCGTTCGGTCGACTCACATGACTGTCTCC-3' . Das PCR-Produkt wurde auf 1 % Agarose/TBE-Gelen aufgetrennt. Die 1734-bp-Bande wurde gelgereinigt (Qiaquick, Qiagen), mit BsiWI/Sall verdaut und unter Verwendung von NxGenT4-DNA-Ligase (Lucigen) in das T7TerVHE-Plasmid ligiert. Oben wurde eine hocheffiziente Transformation beschrieben, um eine Plasmidbibliothek mit einer Diversität von ~6,3 × 106 zu erstellen.

Das Vaccinia-Vektor-V7.5-Virus (Vaccinex) wurde mit Proteinase K (Thermo Fisher) verdaut und die DNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt. V7.5-Virus-DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen ApaI (NEB) und NotI (NEB) verdaut und mit Amicon Ultra-Zentrifugalsäulen (Millipore Sigma) gereinigt. BSC-1-Zellen wurden mit Helfer-Geflügelpockenvirus bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1,5 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro Zelle infiziert und mit verdauter V7.5-Vektor-DNA und jeder Rezeptorbibliothek und den entsprechenden Kontrollplasmiden transfiziert. Infizierte/transfizierte Zellen wurden 5 Tage lang inkubiert und das Vaccinia-Virus wurde durch Einfrieren und Auftauen der Zellen geerntet. Einzelne Plaques für Kontrollklone wurden ausgewählt und amplifiziert. Virale DNA wurde durch PCR gereinigt und amplifiziert. Positive Klone wurden durch Sequenzierung bestätigt. Der Virusbestand für die Bibliothek wurde mittels Plaque-Assay titriert. Einzelne Klone wurden zufällig ausgewählt und mittels PCR auf Rekombinationseffizienz überprüft. Die resultierenden Vaccinia-Bibliotheken hatten eine positive Rekombinationseffizienz von über 95 % und enthielten ~1,3 × 108 bzw. ~1,1 × 108 einzigartige Rekombinanten für NTR1 bzw. PTH1R.

A-431-Zellen wurden am Tag vor der Infektion in DMEM + 10 % (v/v) FBS ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 verdoppelt. Die Zellen wurden dann über Nacht mit einer MOI von 1 pfu pro Zelle mit Virus-exprimierenden NTR1-Kontrollen oder der Bibliothek infiziert. Die entsprechende PFU des Virus wurde in einem minimalen Mediumvolumen verdünnt, um die Zellmonoschicht zu bedecken, und 1–2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit ausreichend Medium überschichtet und 16–18 Stunden lang inkubieren gelassen. Die Zellen wurden mit Accutase™ geerntet, pelletiert und in FACS-Puffer [PBS, 1 % (w/v) BSA] oder Tris-Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 118 mM NaCl, 5,6 mM Glucose, 1,2 mM KH2PO4 gewaschen , 1,2 mM MgSO4, 4,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 0,1 % (w/v) BSA]. Die Zellen wurden mit 2 × 106 Zellen pro ml in FACS-Puffer oder Tris-Puffer resuspendiert und mit fluoreszierendem Liganden 1–2 Stunden lang auf Eis inkubiert. Um die Spezifität zu bestätigen, wurden doppelte Zellproben auch mit einem 100-fachen Überschuss an unmarkiertem Liganden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen im geeigneten Puffer gewaschen und in 0,5 % Paraformaldehyd mit Propidiumiodid fixiert, um vor der Analyse auf dem Durchflusszytometer lebende/tote Zellen zu unterscheiden. Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 8 veranschaulicht.

A-431-Zellen, die mit einer Bibliothek von NTR1-Klonen infiziert waren, wurden für mehrere Iterationen unter Verwendung von 40 nM NT(8–13)-HL647 sortiert. Für die erste Sortierrunde wurden 4 × 107 A-431-Zellen mit der NTR1-Bibliothek bei einer MOI von 1 über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 infiziert, wie oben beschrieben. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit Accutase™ geerntet und mit 40 nM des Liganden in 1 ml Gesamtvolumen FACS-Puffer auf Eis eine Stunde lang unter gelegentlichem, leichtem Schwenken gefärbt. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen, mit 2 × 107 Zellen pro ml resuspendiert und durch einen 40-µm-Filter geleitet, bevor sie auf dem BD FACS Aria-Sortierer sortiert wurden. Die obersten 0,3 % fluoreszierenden Zellen wurden gesammelt (insgesamt 6800), durch mehrere Einfrier-/Auftauzyklen lysiert und das Virus in mehreren Flaschen mit BSC-1-Zellen für 2–3 Tage amplifiziert.

Das amplifizierte Virus wurde geerntet und titriert, bevor es erneut zur Infektion von A-431-Zellen für eine zweite Sortierrunde verwendet wurde. Da die Diversität des Pools aus der ersten Sorte nur 6800 betrug, wurden für die zweite Sorte 3 × 106 A-431-Zellen infiziert. Die oberen 0,06 % der Ereignisse wurden wie oben gesammelt und verstärkt. Die Anreicherung der Sorte wurde durch kleinflächige Infektionen und durchgehende Ligandenfärbung getestet.

Mit einer Bibliothek von PTH1R-Klonen infizierte A-431-Zellen wurden für mehrere Iterationen unter Verwendung von 120 nM M-PTH(1–14)-HL647 oder 120 nM PTH'(1–34)-HL647 sortiert. Für die erste Sortierrunde wurden 1,2 × 108 A-431-Zellen mit der PTH1R T7-induzierbaren Bibliothek und dem abgeschwächten T7-Promotorvirus bei einer MOI von 1 über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2 infiziert, wie oben beschrieben. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit Accutase™ geerntet und mit 120 nM Ligand in 6 ml Gesamtvolumen eine Stunde lang auf Eis unter gelegentlichem, leichtem Schwenken gefärbt. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen, mit 2 × 106 Zellen pro ml resuspendiert und durch einen 40-µm-Filter geleitet, bevor sie auf einem BD FACS Aria-Sortierer sortiert wurden. Die obersten 0,5 % fluoreszierenden Zellen wurden gesammelt, durch mehrere Einfrier-/Auftauzyklen lysiert und das Virus in mehreren Flaschen mit BSC-1-Zellen für 2–3 Tage amplifiziert.

Das amplifizierte Virus wurde geerntet und titriert, bevor es erneut zur Infektion von A-431-Zellen für eine zweite Sortierrunde verwendet wurde. Jede weitere Sortierrunde wurde mit 1,5 × 107 A-431-Zellen durchgeführt und die Gating-Stringenz wurde für jede Runde erhöht. Die Sortenanreicherung wurde als kleinflächige Infektion und durchgehende Ligandenfärbung getestet.

Vaccinia-DNA wurde aus den sortierten Pools extrahiert (DNA Blood mini, Qiagen). Poolvarianten wurden aus der Pool-DNA mittels PCR (Advantage2-Polymerase, Clontech) nach Standardprotokollen mit minimalem Zyklus amplifiziert. Für NTR1 die Primer NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3' und NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCCGGGTG-3' (EFMOD) und für PTHR1 Signal Sense 5'-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' und PTHR1AS 5'-CCCCCCTCGAGGTCG ACTCCACATGACTGTCTCCC-3'. PCR-Produkte wurden anschließend in den Säugetier-Expressionsvektor EFMOD kloniert. Minibibliotheken wurden durch Auswahl von 92–94 Kolonien und Isolierung von Plasmid-DNA (Qiaprep 96 turbo, Qiagen) hergestellt. DNA-Sequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von 2–3 Primern für eine vollständige Abdeckung analysiert.

Mini-Gs 393 wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben44 hergestellt. Kurz gesagt, Mini-Gs wurden im E. coli-Stamm BL21 (DE3) bei 20 ° C exprimiert. Die Zellen wurden 16–20 Stunden nach der Induktion durch Zentrifugation geerntet und in Lysepuffer [40 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 10 % (v/v) Glycerin, 5 mM MgCl2, 50 μM GDP resuspendiert , 1 mM DTT, 50 µg/ml DNAseI, 50 µg/ml Lysozym] und in einem HPL6-Zelllysegerät (Maximator GmbH) bei 1700 bar aufgeschlossen. Die Lysate wurden durch Zentrifugation (20.000 g für 45 Minuten) geklärt und die Überstände auf Ni-NTA-Säulen (Thermo Fisher Scientific) geladen. Die Säulen wurden mit 10 CV-Waschpuffer [20 mM HEPES (pH 7,5), 500 mM NaCl, 28 mM Imidazol, 10 % (v/v) Glycerin, 1 mM MgCl2, 50 μM GDP, 1 mM DTT] und gebundenen Proteinen gewaschen wurden schrittweise in 2 CV Elutionspuffer [20 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 10 % (v/v) Glycerin, 1 mM MgCl2, 50 μM GDP, 0,5 mM DTT] eluiert. Imidazol wurde auf PD-10-Entsalzungssäulen (Cytiva) entfernt, die Proteine ​​wurden auf 25 mg/ml konzentriert und in Gefrierpuffer [25 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 15 % (v/v) Glycerin, 5 mM MgCl2, 10 μM GDP, 0,25 mM DTT].

Rezeptorvarianten wurden vorübergehend in HEK293T-Zellen transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Accutase™ abgelöst und mit 20 nM HL488-NT(8–13) oder 100 nM PTH'(1–34)-HL647 in PBS, ergänzt mit 0,2 % BSA, 2–4 Stunden lang auf Eis inkubiert . Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart eines 100-fachen Überschusses an unmarkiertem Peptid bestimmt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und die Fluoreszenzintensitäten mit einem FACSCanto II-Durchflusszytometer (BD Biosciences) bestimmt.

Ligandenbindungsexperimente wurden an ganzen Zellen oder an Zellmembranen durchgeführt, die aus vorübergehend transfizierten HEK293T-Zellen erhalten wurden, wobei in beiden Fällen ein HTRF-Bindungstest wie zuvor beschrieben verwendet wurde11,14. Alle Rezeptorvarianten wurden in einen Säugetier-Expressionsvektor subkloniert, der einen N-terminalen SNAP-Tag (Cisbio) enthielt. Bei NTR1-Konstrukten wurde der SNAP-Tag an Rest 43 des Rezeptors fusioniert. Für PTH1R wurde der SNAP-Tag entweder an Rest 29 oder an Rest 171 fusioniert, wodurch der ECD eliminiert wurde. HEK293T-Zellen wurden vorübergehend mit Rezeptorkonstrukten transfiziert und mit 20.000 Zellen pro Vertiefung in mit Poly-L-Lysin beschichtete Platten mit 384 Vertiefungen (Greiner) für Ganzzellbindungstests oder mit 5 × 106 Zellen in 10-cm-Petrischalen für Membranen ausgesät Vorbereitung. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 50 nM SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) in Ligandenbindungspuffer [20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2 und 0,02 % (w/v) BSA] 2 Stunden lang inkubiert bei 37 °C. Die Zellen wurden viermal mit Assay-Puffer gewaschen und direkt für Ligandenbindungsexperimente ganzer Zellen verwendet, oder es wurden rohe Zellmembranextrakte wie zuvor beschrieben hergestellt. Zellen oder 0,2–1 µg Membranen pro Vertiefung wurden dann 4 Stunden lang auf Eis inkubiert, um die Ligandenbindung zu messen, die fluoreszierend markiertes Tracerpeptid zusammen mit einem Konzentrationsbereich an unmarkiertem Konkurrenzpeptid enthielt. Für NTR1 wurden 2 nM HL488-NT(8–13) als Tracerpeptid verwendet. Für PTH1R wurden 50 nM M-PTH(1–14)-HL647 oder 20 nM PTH'(1–34)-HL647 verwendet. Die Fluoreszenzintensitäten wurden auf einem Spark-Fluoreszenzplattenlesegerät (Tecan) mit einer Anregungswellenlänge von 340 nm und Emissionswellenlängen von 620 nm, 520 nm und 665 nM für Tb3+, HiLyte Fluor 488 bzw. HiLyte Fluor 647 gemessen. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von FRET-Donor und -Akzeptor wurde berechnet. Die vollständige Bindung wurde in Abwesenheit eines Kompetitors erreicht und die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart eines 100-fachen Überschusses an unmarkiertem Peptid bestimmt. Die Daten wurden für jedes einzelne Experiment auf die spezifische Bindung normiert und durch globale Anpassung an eine heterologe Konkurrenzgleichung an einer Stelle analysiert.

Signalexperimente wurden an ganzen Zellen mit vorübergehend transfizierten HEK293T-Zellen durchgeführt, wie zuvor beschrieben11,14. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit Zelldissoziationspuffer (Gibco) abgelöst und erneut in PBS gewaschen. Die Zellen wurden in Assaypuffer [10 mM Hepes (pH 7,4), 146 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 4,2 mM KCl, 5,5 mM Glucose, 50 mM LiCl, 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin) resuspendiert. cAMP- und IP1-Akkumulationstests wurden auf weißen 384-Well-Platten mit geringem Volumen (Greiner) unter Verwendung des cAMP Tb-Kits bzw. des IP-One Tb-Kits (beide von CisBio) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Zur cAMP-Akkumulation wurden 5000 Zellen mit Agonisten in den angegebenen Konzentrationen 30 Minuten lang bei RT inkubiert. Um die basale Rezeptorsignalisierung zu bestimmen, wurden die Zellen in Isobutylmethylxanthin (IBMX) enthaltendem Testpuffer 30 Minuten lang in Abwesenheit eines Liganden inkubiert. Zur IP1-Akkumulation wurden 20.000 Zellen mit Agonisten in den angegebenen Konzentrationen 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Fluoreszenzintensitäten wurden mit einem Spark-Fluoreszenzplattenlesegerät (Tecan) gemessen. Um Konzentrations-Wirkungs-Kurven zu erstellen, wurden die Daten an eine logistische Gleichung mit drei Parametern angepasst.

Die Stabilität entwickelter Rezeptorvarianten wurde in Membranfraktionen vorübergehend transfizierter HEK293T-Zellen gemessen, indem der verbleibende rezeptorgebundene Ligand nach einer Hitzebelastung der Membranen bestimmt wurde. Im Fall von PTH1R wurde die ECD (Reste 1–170) aus den Expressionskonstrukten entfernt, um Stabilitätsmessungen auf die TMD zu beschränken. Für NTR1 wurden die Zellen unverändert gelassen, während für PTH1R die Zellen mit 50 nM SNAP-Lumi-4Tb markiert wurden, bevor die Membranen wie oben beschrieben hergestellt wurden. Die Membranen wurden dann 2–4 Stunden lang auf Eis in Ligandenbindungspuffer inkubiert, der 20 nM [3,11-Tyrosyl-3,5-3H(N)]-Neurotensin (Perkin Elmer) und 500 nM M-PTH( 1–14)-HL647 für NTR1 bzw. für PTH1R. Wo angegeben, wurden den Membranfraktionen vor der Ligandenzugabe 25 µM Mini-Gs-Protein zugesetzt. Anschließend wurden 0,5 µg Membranen pro Well einer 96-Well-Platte verteilt und in einem PCR-Thermocycler 20 Minuten lang auf eine bestimmte Temperatur erhitzt. Anschließend wurden NTR1-haltige Membranen auf Glasfaserfiltern (Millipore) immobilisiert, viermal mit Bindungspuffer gewaschen und die Restaktivität des Radioliganden auf einem MicroBeta Plus 1450-Flüssigkeitsszintillationszähler (Perkin Elmer) gemessen. Für PTH1R wurde die verbleibende Ligandenbindung durch HTRF wie oben beschrieben bestimmt. Die Daten wurden durch nichtlineare Regressionsanpassung analysiert.

Durchflusszytometriedaten wurden in der FlowJo-Software V10 (BD Biosciences) analysiert. Die Datenerfassung und -analyse wurde in Microsoft Excel V2108 durchgeführt. Alle anderen statistischen Analysen und Kurvenanpassungen wurden in Prism V6.07 (GraphPad) durchgeführt. Einzelheiten zu jeder Analyse sind im Abschnitt über experimentelle Methoden, in den Abbildungen, Tabellen und Abbildungslegenden des jeweiligen Experiments aufgeführt. Sequenzausrichtungen und Schlangendiagramme wurden vom GPCRdb58 erhalten. Die Sequenzanalyse wurde mit CLC Workbench V22.0.2 durchgeführt. Sequenzhäufigkeiten wurden mit WebLogo59 visualisiert. Proteinstrukturen wurden mit PyMOL V2.8.2 analysiert und visualisiert. Die statistische Signifikanz der Unterschiede wurde durch einfaktorielle ANOVA und Bonferroni-Mehrfachvergleich ermittelt.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Die Experimente waren nicht randomisiert. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuteilung.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlichen Daten sind in der Arbeit und/oder in den Zusatzinformationen enthalten. Öffentlich verfügbare PDB-Einträge, die in dieser Arbeit verwendet werden: 4BUO, 4L6R). Die in diesem Artikel verwendeten Rezeptorsequenzdaten sind bei GPCRdb verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Frank Murante und Kari Viggiani für die fachkundige technische Unterstützung. Wir möchten auch Pascal Egloff für seine wertvollen Beiträge zum Bibliotheksdesign danken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Akademie der Naturforscher Leopoldina (LPDS 2009-48) und ein Marie-Curie-Stipendium der Europäischen Kommission (FP7-PEOPLE-2011-IEF #299208) an CK sowie durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (31003A_182334) an AP

Institut für Biochemie, Universität Zürich, Winterthurerstrasse 190, CH-8057, Zürich, Schweiz

Christoph Klenk, Anina Niederer & Andreas Plückthun

Vaccinex, Inc., 1895 Mt. Hope Avenue, Rochester, New York, 14620, NY, USA

Maria Scrivens, Shuying Shi, Loretta Mueller, Elaine Gersz, Maurice Zauderer und Ernest S. Smith

MorphoSys AG, Semmelweißstr. 7, 82152, Planegg, Deutschland

Ralf Strohner

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Von CK, ESS, MZ und AP konzipierte Forschung; CK, MS, AN, SS, LM und EG führten Untersuchungen durch; RS steuerte neue Reagenzien bei; CK-, MS-, AN-, ESS-, MZ- und AP-analysierte Daten; CK und AP haben den Artikel geschrieben.

Correspondence to Christoph Klenk or Andreas Plückthun.

MS, SS, LM, EG, MZ und ESS sind Mitarbeiter von Vaccinex, Inc. und besitzen Aktien und/oder Aktienoptionen des Unternehmens. RS ist Mitarbeiter der MorphoSys AG und erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Bryan Roth und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Klenk, C., Scrivens, M., Niederer, A. et al. Ein auf Vaccinia basierendes System zur gerichteten Evolution von GPCRs in Säugetierzellen. Nat Commun 14, 1770 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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Eingegangen: 10. November 2022

Angenommen: 06. März 2023

Veröffentlicht: 30. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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