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Jan 03, 2024

Entwicklung von Rezeptoragonisten mit verbesserter Pharmakokinetik durch Pfropfung makrozyklischer Peptide in fragmentkristallisierbare Regionen

Naturbiomedizinische Technik

Nature Biomedical Engineering Band 7, Seiten 164–176 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Kurze Halbwertszeiten im Blutkreislauf und schlechter Transport über die Blut-Hirn-Schranke schränken den Nutzen von Zytokinen und Wachstumsfaktoren ein, die als Rezeptoragonisten wirken. Hier zeigen wir, dass Ersatzrezeptoragonisten mit längeren Halbwertszeiten im Blutkreislauf und erhöhten Transportraten über die Blut-Hirn-Schranke erzeugt werden können, indem makrozyklische Peptidpharmakophore genetisch in die Strukturschleifen der fragmentkristallisierbaren (Fc) Region eines menschlichen Immunglobulins eingefügt werden. Wir verwendeten einen solchen „Lasso-Grafting“-Ansatz, der die Expressionsniveaus der Fc-Region und ihre Affinität zum neonatalen Fc-Rezeptor bewahrt, um Fc-basierte Proteingerüste mit makrozyklischen Peptiden zu erzeugen, die an die Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase Met binden. Die Met-Agonisten dimerisierten Met und lösten biologische Reaktionen aus, die denen ähnelten, die durch seinen natürlichen Liganden hervorgerufen wurden. Darüber hinaus steigerte die Lassotransplantation der Fc-Region des Maus-Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörpers mit Met-bindenden makrozyklischen Peptiden die Akkumulation der resultierenden Met-Agonisten im Gehirnparenchym von Mäusen. Lasso-Transplantation könnte Designer-Proteintherapeutika mit verbesserter Stabilität und Pharmakokinetik ermöglichen.

Die klinische Verwendung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren als Therapeutika wurde von der US-amerikanischen Food and Drug Administration1,2 genehmigt, und ihre potenzielle Anwendung in neuen Bereichen wie Neurogenese und Gehirnreparatur3,4 ist Gegenstand intensiver Forschung. Aufgrund ihrer inhärenten strukturellen Eigenschaften ist es jedoch schwierig, sie für eine verbesserte physikalisch-chemische Stabilität und Pharmakokinetik zu entwickeln, insbesondere für eine bessere Halbwertszeit oder bessere Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke (BBB). Bestehende Methoden zur Steuerung der Pharmakokinetik von Proteintherapeutika umfassen die Konjugation und Fusion von Polyethylenglykol mit der fragmentkristallisierbaren (Fc) Region des Immunglobulins5,6,7, um deren Halbwertszeiten zu verlängern; und Fusion mit Fab des Anti-Transferrin-Rezeptor (TfR)-Antikörpers, um deren Penetration durch die Blut-Hirn-Schranke zu verbessern8,9,10. Das Ausmaß, in dem diese Methoden die Pharmakokinetik der Proteine ​​verbessern können, ohne ihre Bioaktivitäten zu beeinträchtigen, hängt jedoch von den Eigenschaften jedes Proteins ab5,6,7,8. Um die inhärenten strukturellen Einschränkungen von Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu überwinden, wurden Fortschritte bei der Entwicklung von Ersatzagonisten erzielt, die strukturell nichts mit nativen Liganden zu tun haben11,12. Trotz dieser jüngsten Fortschritte besteht weiterhin ein großer ungedeckter Bedarf an robusteren und vielseitigeren Methoden zur Entwicklung von Proteintherapeutika mit der gewünschten physikalisch-chemischen Stabilität und Pharmakokinetik.

Makrozyklische Peptide haben sich als vielversprechende neue Klasse von Arzneimittelkandidaten herausgestellt, die über eine Reihe wünschenswerter Eigenschaften verfügen, wie z. B. antikörperähnliche Bindungsaffinität und -spezifität13,14, die Fähigkeit, einzigartige chemische Räume anzusprechen15,16,17,18 und eine effiziente Entdeckung durch beide rationalen Methoden /Computerdesign und In-vitro-Anzeige18,19,20,21. Im Allgemeinen weisen makrozyklische Peptide aufgrund ihrer eingeschränkten zyklischen Strukturen eine größere Affinität zu Zielen auf als lineare Peptide. Eine interessante Möglichkeit, die Anwendbarkeit dieser makrozyklischen Peptide zu erweitern, besteht darin, sie auf Proteingerüste zu „verpflanzen“, um funktionelle Kombinationen von Peptid und Protein zu ermöglichen18,22,23,24,25,26. Das Pfropfen de novo identifizierter Peptide auf Proteinschleifen war jedoch aufgrund der möglichen Fehlfaltung sowohl des gepfropften Peptids als auch des Wirtsproteins eine Herausforderung26.

Die Entwicklung des RaPID-Systems (Random Non-Standard Peptides Integrated Discovery), das die Anzeige von Boten-RNA und die Neuprogrammierung des genetischen Codes integriert, hat die Entdeckung von Thioether-basierten zyklisierten makrozyklischen Peptiden mit hervorragender Bindungsspezifität gegenüber Zielproteinen ermöglicht16,17,18. In früheren Studien haben wir gezeigt, dass von RaPID abgeleitete Pharmakophorsequenzen problemlos in oberflächenexponierte Proteinschleifen implantiert werden können und sowohl die Funktionen des Gastpeptids als auch des Wirtsproteins aufrechterhalten, was wir als „Lasso-Transplantation“ bezeichneten27,28,29 . Die beobachtete außergewöhnliche Pfropfkompatibilität ist wahrscheinlich auf die intrinsische Eigenschaft der Pharmakophormotive zurückzuführen, sich selbst im Zusammenhang mit der nicht verwandten Schleifenstruktur der Gerüstproteine ​​in eine Zielbindungskonformation ähnlich dem übergeordneten Makrozyklus zu falten18,30.

In dieser Studie nutzen wir die wünschenswerten Gerüsteigenschaften des Fc-Fragments, seine lange Halbwertszeit, seine Vielseitigkeit in Kombination mit Fab5,6,31,32 und die einfache Herstellung, um die Machbarkeit und Anwendung der Lasso-Transplantation zu zeigen. Unter Verwendung des Fc als Gerüst haben wir Met-Rezeptor-Agonisten entwickelt, die sich durch eine deutlich verbesserte Halbwertszeit und BHS-Penetranz auszeichnen.

Met ist eine Rezeptortyrosinkinase, die durch Dimerisierung aktiviert wird, die durch ihren Liganden, den Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), ausgelöst wird. Met-HGF ist zentral an der Morphogenese während der Entwicklung, der Wundreparatur und der Organhomöostase beteiligt, indem es das Zellwachstum, das Überleben und die Migration stimuliert33,34. Rekombinantes HGF-Protein zeigt therapeutische Wirksamkeit in präklinischen Modellen34,35 und bei Patienten mit spezifischen Krankheiten36,37. Allerdings haben seine kurze Halbwertszeit und die Unfähigkeit, über die BHS hinaus abgegeben zu werden, sein Potenzial für medizinische Anwendungen lange Zeit eingeschränkt38,39. Um diese Mängel zu beheben, haben wir durch Lasso-Transplantation die linearisierte Pharmakophorsequenz von aMD4 oder aMD5, zwei makrozyklische Peptide, die an die Ektodomäne von Met40 binden, in jede der acht Schleifen von Fc eingefügt (Abb. 1a). Diese beiden Serien von aMD4- oder aMD5-gepfropften Fc-Fragmenten (im Folgenden Fc(aMD4) bzw. Fc(aMD5) genannt), die jeweils zwei Met-Binder im Abstand von 31–42 Å aufweisen, haben das Potenzial, zwei Met-Rezeptoren in die Nähe zu bringen der Zelloberfläche. Die Expressionsniveaus von Fc(aMD4) und Fc(aMD5) in Expi293F-Zellen waren denen des Kontroll-Fc ähnlich, mit Ausnahme von Fc(aMD5)T3 (Erweiterte Daten, Abb. 1), was darauf hindeutet, dass die Lassotransplantation im Allgemeinen erhalten blieb hoher Ausdruck von Fc.

a: Pharmakophorsequenzen von Met-Bindern (aMD4 oder aMD5; rot dargestellt) wurden in die Schleifen (T1 bis B3; farbig) des menschlichen IgG1-Fc-Proteins (PDB-ID: 1h3w) eingefügt. Auf der rechten Seite sind die Aminosäuresequenzen von Fc, gepfropften Peptiden und Pfropfstellen dargestellt. b,c, Zelluläre Met-Aktivierung durch aMD4-gepfropftes Fc (Fc(aMD4)) (b) oder aMD5-gepfropftes Fc (Fc(aMD5)) (c). EHMES-1-Zellen wurden mit Fc-Varianten (farbig) oder Dimerpeptiden (grau) behandelt. Die zelluläre Met-Aktivierung wurde in situ mit dem Anti-Phospho-Met-Antikörper (Tyr1234/1235) quantifiziert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6 unabhängige Experimente) in Prozent von Phospho-Met im Verhältnis zur maximalen Met-Phosphorylierung, die durch 1,1 nM HGF induziert wird, angezeigt. Links: T1, T2 und T3. Mitte: M2 und M3. Rechts: B1, B2 und B3.

Quelldaten

Die Aktivierung von zellulärem Met durch gereinigtes Fc(aMD4) oder Fc(aMD5) hing stark von der Transplantationsstelle ab (Abb. 1b, c), wobei B3 die optimale Stelle für aMD4 war (Abb. 1b). Unsere Analysen zeigen, dass Fc(aMD4)B3 Met mit einer halbmaximalen wirksamen Konzentration (EC50) aktivierte, die mit der des nicht gepfropften aMD4-Dimer-Peptids vergleichbar ist (EC50: 4,5 ± 0,2 nM gegenüber 5,1 ± 0,6 nM) und einem leicht reduzierten Maximum Aktivierung im Vergleich zur HGF-induzierten Phosphorylierung (74,8 % ± 0,4 % gegenüber 101,3 % ± 0,1 %). Im Gegensatz dazu führte das Pfropfen von aMD4 in andere Schleifen zu einer geringeren Met-Aktivierung im Vergleich zum aMD4-Dimerpeptid. Im Fall von aMD5 war B1 die beste Pfropfstelle, wo Fc(aMD5)B1 Met mit einem 3,7-fach höheren EC50 im Vergleich zu nicht gepfropftem aMD5-Dimerpeptid und einer etwas niedrigeren maximalen Aktivierung aktivierte (EC50: 16,6 ± 1,6 nM vs 4,5 ± 0,2 nM; maximale Aktivierung: 76,2 % ± 1,4 % gegenüber 105,0 % ± 4,2 %; Abb. 1c). Durch das Pfropfen von aMD5 in andere Schleifen wurde die Met-Aktivierung entweder reduziert oder aufgehoben. Bemerkenswerterweise korrelierten die agonistischen Aktivitäten von Lasso-transplantiertem Fc gut mit ihren Bindungsstärken an Zelloberflächen-Met (ergänzende Abbildung 1a) oder Met-Ektodomänenfragment (MetECD) (erweiterte Daten, Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1b), was auf ihre Wirksamkeit hinweist werden weitgehend durch ihre Affinität zu Met bestimmt. Der Unterschied in der Pfropfstellenabhängigkeit der beiden Peptide ist wahrscheinlich auf die sterischen Effekte zurückzuführen, die durch den Unterschied in ihrer Bindungsstelle auf der Met-Ektodomäne und ihre unterschiedlichen räumlichen Anordnungen in der Fc-Struktur verursacht werden (ergänzende Abbildung 2).

Um die agonistische Aktivität zu verbessern, haben wir an jedem Ende der aMD4-Sequenz einen Cys-Rest angehängt, um über eine Disulfidbindung eine eng geschlossene makrozyklische Konformation zu fördern (Abb. 2a und ergänzende Abb. 3). Die disulfidgebundenen Derivate aMD4 (im Folgenden mit „ds“ vorangestellt) zeigten bei T1 und B3 eine größere maximale Met-Aktivierung als die Kontrolle (T1, P = 0,039; B3, P <0,0001), während im EC50 (Supplementary) keine Auswirkungen beobachtet wurden Abb. 3f) und Dissoziationskonstantenwerte (KD) der MetECD-Bindung (Extended Data Abb. 2). Im Gegensatz dazu zeigte dsB2 keine Verbesserung der agonistischen Aktivität, der maximalen Aktivierung oder der EC50-Werte (ergänzende Abbildung 3f), was darauf hindeutet, dass die verringerte Met-Affinität nach dem Pfropfen in diese beiden Stellen nicht auf eine suboptimale Konformation des gepfropften Peptidmotivs an sich zurückzuführen ist. Dies wurde durch die ähnlichen Konformationen von aMD4 oder aMD5 bei der Transplantation an der B1- oder B3-Position weiter gestützt (ergänzende Abbildung 2).

a, Zelluläre Met-Aktivierung, gemessen durch Phospho-Met (Tyr1234/1235), induziert durch Fc(aMD4)B3, Fc(aMD4ds)B3 und HGF in EHMES-1-Zellen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3 unabhängige Experimente) angezeigt. b–g: Die durch Fc(aMD4)B3 induzierte Hepatozytenreaktion ist vergleichbar mit der durch HGF induzierten. b, Zelluläre Signalübertragung in menschlichen Hepatozyten, behandelt mit HGF, Fc(aMD4)B3 oder Kontroll-Fc (100 nM). Die Lysate wurden mittels Western Blot analysiert. c: Phospho-Rezeptor-Tyrosinkinase-Arrays, die die Selektivität von Fc(aMD4)B3 für Met zeigen. Menschliche Hepatozyten wurden mit HGF, Fc(aMD4)B3 oder Fc stimuliert. d–g, Ähnliche Genexpressionsprofile in primären menschlichen Hepatozyten-Sphäroiden, induziert durch Fc(aMD4)B3 und HGF. d, Schema der Hepatozyten-Sphäroid-Induktion und -Stimulation durch HGF oder Fc(aMD4)B3. Es wird ein repräsentatives Bild angezeigt. Maßstabsbalken, 200 µm. e, Ein Streudiagramm, das die Korrelation zwischen den durch HGF und Fc(aMD4)B3 induzierten Genexpressionsänderungen nach 24 Stunden zeigt. Die blau gepunktete Linie zeigt die Regressionslinie an. f, Wärmekarte der DEGs von HGF- oder Fc(aMD4)B3-behandelten Hepatozyten-Sphäroiden im Vergleich zu unbehandelten Hepatozyten-Sphäroiden (n = 2 pro Gruppe, Falscherkennungsrate (FDR) < 0,05, Benjamini-Hochberg, zweiseitig). g, Repräsentative signifikant angereicherte GO-Terme und ihre Heatmaps für DEGs von HGF- oder Fc(aMD4)B3-behandelten Hepatozyten-Sphäroiden im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (24 h, FDR < 0,05, Benjamini-Hochberg, zweiseitig).

Quelldaten

Die durch Fc(aMD4)B3 in EHMES-1-Zellen oder in Hepatozyten induzierten zellulären Reaktionen waren in hohem Maße mit denen von HGF vergleichbar (Abb. 2 und Extended Data Abb. 3). Fc(aMD4)B3 bei 1 nM induzierte die Phosphorylierung von Met bei Y1234/1235 und aktivierte die anschließende Downstream-Signalisierung mit Phosphorylierung von Akt und Erk1/2 in Mengen, die mit denen durch HGF induzierten vergleichbar waren (Abb. 2b und ergänzende Abb. 4). Die durch Fc(aMD4)B3 und HGF an drei verschiedenen Tyrosinresten von Met induzierten Phosphorylierungsgrade sowie die Induktionskinetik der Met-, Akt- und Erk1/2-Phosphorylierung waren vergleichbar (Extended Data Abb. 3). Die Selektivität von Fc(aMD4)B3 für Met wurde durch eine Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung von 49 Rezeptoren bestätigt (Abb. 2c und ergänzende Abb. 5). Die durch Fc(aMD4)B3 oder HGF induzierten Veränderungen der Genexpression wurden in primären menschlichen Hepatozyten-Sphäroidkulturen mittels RNA-seq untersucht (Abb. 2d – g). Ein Streudiagramm zeigt die Korrelation der durch HGF und Fc(aMD4)B3 induzierten Genexpressionsänderungen im Vergleich zu unbehandelten Sphäroiden (Abb. 2e). Schließlich zeigt eine Wärmekarte der differentiell exprimierten Gene (DEGs) im Vergleich zu unbehandelten Sphäroiden, dass sowohl Fc(aMD4)B3 als auch HGF die Expression von mehr als 2.000 Transkripten in ähnlicher Weise veränderten (Abb. 2f), was zu einer signifikanten Bereicherung der Genontologie (GO) führte. Begriffe im Zusammenhang mit Wundheilung und Leberfunktionen (Abb. 2g).

Da de novo erzeugte Peptide auf völlig andere Weise als die nativen Liganden unterschiedlich an die Zielrezeptoren binden könnten, könnten wir theoretisch Agonisten erzeugen, die nicht mit nativen Liganden konkurrieren oder in der Lage sind, mutierte Rezeptoren zu aktivieren, denen die Ligandenbindung fehlt. Um dieses Potenzial zu untersuchen, kartierten wir zunächst die mutmaßliche Fc(aMD4)B3-Bindungsstelle (in Abb. 3a rot dargestellt) mithilfe chimärer MetECD-Fragmente, die MetECD von Mensch und Maus variabel fusionierten (Extended Data Abb. 4) und dabei die Spezifität von aMD4 ausnutzten für menschliches Met40. Die mutmaßliche Bindungsstelle ist auf der Unterseite der Sema-Domäne von Met abgebildet, die nicht mit der HGF-Bindungsstelle41 überlappt, was erklärt, warum das aMD4-Peptid nicht mit der HGF-induzierten Met-Aktivierung konkurriert40.

a, Essentielle (rot) und Hilfsreste (orange) für die Bindung von Fc(aMD4)B3 in der Sema-Domäne (PDB-ID: 1shy). Die SP-Domäne von HGF ist gelb dargestellt. Erfüllte Ektodomänenstruktur aus vorhergesagten Modellen (PDI-ID: 1ux3 für Sema bis IPT1, 2cew für IPT2 bis IPT4). b, Met-Dimerbildung durch Fc(aMD4) in vitro. Die Komplexe zwischen MetECD und Fc(aMD4) oder Kontroll-Fc wurden durch BS3 vernetzt und durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert und mit Silber gefärbt. c–f, Repräsentative sequentielle HS-AFM-Bilder von Fc(aMD4)B3 (c), MetECD (d) und 2:1-Komplexen des durch Fc(aMD4)B3 induzierten Met-Dimers (e,f). Schematische Interpretationen der HS-AFM-Bilder sind in e und f (obere Felder) dargestellt. Pfeilspitzen zeigen die Sema-Domäne an. Die Reinigung des Komplexes ist in der erweiterten Datenabbildung 5c ​​dargestellt. Für jede Probe wurden mindestens fünf Moleküle oder Komplexe beobachtet. Die Farben (von Schwarz bis Weiß) entsprechen der zunehmenden Höhe der Moleküle. Maßstabsbalken, 20 nm. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander zweimal wiederholt und lieferten vergleichbare Ergebnisse.

Als nächstes untersuchten wir die Struktur des durch Fc(aMD4) induzierten Met-Dimers. Komplexe zwischen MetECD und Fc(aMD4) wurden durch Vernetzung mit Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3) stabilisiert und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert (Abb. 3b und Extended Data Abb. 5a,b). Die Ergebnisse deuteten auf die Bildung von Komplexen zwischen MetECD und Fc(aMD4) in 1:1- oder 2:1-Stöchiometrie hin. Die relative Effizienz verschiedener Fc(aMD4) bei der Bildung eines 2:1-Signalkomplexes lag in der Reihenfolge B3 > B1 > B2, was gut mit ihrer Fähigkeit korrelierte, zelluläres Met zu aktivieren. Der BS3-vernetzte 2:1-Komplex aus MetECD und Fc(aMD4)B3 wurde durch Größenausschlusschromatographie (Extended Data Abb. 5c) gereinigt und einer Einzelmoleküluntersuchung mittels Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM)42 unterzogen. mit Fc und MetECD als Kontrollen (Abb. 3c – f und Zusatzvideos 1–4). Auf HS-AFM zeigte MetECD eine globuläre Sema-Domäne und Ig-ähnliche Plexine-Transkriptionsfaktoren (IPT)-Stieldomänen, wobei die relative Positionierung jeder IPT-Domäne flexibel ist (Abb. 3d und Zusatzvideo 2). Fc(aMD4)B3 band an die Unterseite der Sema-Domäne und überbrückte zwei Met-Moleküle, während die IPT-Stieldomänen weggesprüht (Abb. 3e und Zusatzvideo 3) oder angehängt wurden (Abb. 3f und Zusatzvideo 4). Die Flexibilität der IPT-Domänen ermöglicht wahrscheinlich die ordnungsgemäße Assoziation der intrazellulären Kinasedomänen zweier Met-Moleküle, wobei diese Assoziation für die Met-Aktivierung wesentlich ist33,34. Diese Ergebnisse zeigen, dass Fc(aMD4)B3 zwar an Met an einer anderen Stelle als in HGF bindet, seine Rekrutierung von zwei Met-Rezeptoren in unmittelbarer Nähe es ihm jedoch ermöglicht, Met im gleichen Ausmaß wie HGF zu aktivieren.

Die langen Halbwertszeiten von Fc und Antikörpern werden hauptsächlich durch ihre Bindung an FcRn43,44,45,46 aufrechterhalten. Aus diesem Grund haben wir eine selektive Lassotransplantation an Schleifenstellen durchgeführt, die distal von der FcRn-Bindungsstelle liegen (Abb. 4a). Dementsprechend zeigte unsere Analyse der Bindungskinetik zwischen Fc(aMD4) und immobilisiertem FcRn, dass das Lasso-Transplantieren in die meisten Schleifen keinen Einfluss auf die Affinität von Fc zu FcRn hatte, obwohl Fc(aMD4)T2 und M2 etwas höhere KD-Werte aufwiesen als Kontroll-Fc ( Abb. 4b und erweiterte Daten Abb. 6). Dies legt nahe, dass die Lasso-Transplantation auf Fc die Affinität von Fc zu FcRn bewahrt.

a: Mit Peptiden eingefügte Schleifen (T1 bis B3) in Fc (grau) sind von der Bindungsstelle zu FcRn (orange) und β2-Mikroglobulin (β2M, gelb) entfernt (PDB-ID: 4N0U). b, KD-Werte von Fc und Fc(aMD4) bis FcRn/β2M, bestimmt durch Oberflächenplasmonresonanz. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (Duplikate von 3 Analytkonzentrationen; ungepaarter zweiseitiger t-Test) angezeigt. c,d, Fc(aMD4)B3 zeigte bei Mäusen eine lange Serumhalbwertszeit. Wildtyp-C57BL/6-Mäusen (c) oder mFcRn−/− hFcRn+-Mäusen (d) wurde eine einzelne Injektion einer äquimolaren Menge pro kg Fc (0,7 mg kg−1), Fc(aMD4)B3 (0,74 mg kg) verabreicht −1) oder HGF (1,0 mg kg−1) über die Schwanzvene verabreicht und die Serumkonzentrationen wurden mittels ELISA bestimmt. Die Ergebnisse werden als Einzelwerte (n = 6 Mäuse pro Gruppe) (c) oder Mittelwert ± Standardabweichung (d) (n = 10 Mäuse pro Gruppe) angezeigt. Bei HGF lagen einige Proben unterhalb der Nachweisgrenze. e–j, In-vivo-Aktivität von Fc(aMD4)B3 in Mäusen mit humanisierter Leber (PXB-Mäuse). e, Schema. f,g, Replikative DNA-Synthese. f, Repräsentative Bilder, die die BrdU-Färbung in der Leber von mit Fc(aMD4)B3 oder PBS behandelten Mäusen zeigen. Maßstabsbalken, 100 µm. g, Prozentsatz der BrdU+-Zellen in der Leber. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4 Mäuse pro Gruppe; ungepaarter zweiseitiger t-Test) dargestellt. h–j, Genexpressionsprofile. h, Wärmekarte von DEGs zwischen Fc(aMD4)B3-behandelten und PBS-behandelten PXB-Mäuselebern (n = 4 Mäuse pro Gruppe, FDR < 0,01, Benjamini-Hochberg, zweiseitig). i,j, Repräsentative angereicherte GO-Begriffe im Hinblick auf die fache Anreicherung (i) oder die Anzahl der Gene (j) für DEGs von Fc(aMD4)B3-behandelten Lebern im Vergleich zur PBS-behandelten Kontrolle (FDR < 0,01, Benjamini-Hochberg, zwei). -seitig).

Quelldaten

Als nächstes bewerteten wir die Serumhalbwertszeit von Fc(aMD4)B3 im Vergleich zu denen von Kontroll-Fc und HGF bei Wildtyp-Mäusen nach einer einzelnen intravenösen (iv) Verabreichung in einer äquimolaren Menge pro kg (Abb. 4c). Die Serumkonzentration von HGF sank innerhalb einer Stunde auf unter 0,01 nM, wodurch Met nicht aktiviert werden konnte. Im Gegensatz dazu zeigte Fc(aMD4)B3 eine verlängerte Halbwertszeit, die mit der von Kontroll-Fc vergleichbar war (Abb. 4c). Um die Pharmakokinetik unserer humanen Fc-basierten Varianten genau zu bestimmen, haben wir die Serumhalbwertszeiten von Fc(aMD4)B3 und Kontroll-Fc in mFcRn−/− hFcRn+-Mäusen gemessen (Abb. 4d). Die Serumhalbwertszeit von Fc(aMD4)B3 betrug bei diesen Mäusen 49,4 Stunden und war vergleichbar mit der von Kontroll-Fc (46,6 Stunden). Die Serumkonzentration von Fc(aMD4)B3 blieb nach einer einzelnen iv-Verabreichung von 0,74 mg kg−1 bis zu 200 Stunden lang über 1 nM, der Mindestkonzentration zur Aktivierung von Met (Abb. 2a, b) (Abb. 4d).

Als nächstes wurde die In-vivo-Aktivität von Fc(aMD4)B3 unter Verwendung chimärer Mäuse untersucht, denen menschliche Hepatozyten transplantiert wurden, wobei etwa 80 % der Hepatozyten humanisiert waren (PXB-Mäuse)48, da Fc(aMD4)B3 nicht in der Lage ist, murines Met40 zu aktivieren. Wir haben erstmals die verlängerte Serumhalbwertszeit von Fc(aMD4)B3 in PXB-Mäusen nach einer einzelnen iv- oder subkutanen (sc) Injektion von 5 mg kg-1 bestätigt (ergänzende Abbildung 6). Anschließend wurde die Proliferation und Genexpression menschlicher Hepatozyten 46 Stunden nach einer einzelnen sc-Injektion von Fc(aMD4)B3 oder PBS in PXB-Mäusen analysiert (Abb. 4e – j). Fc(aMD4)B3 erhöhte die replikative DNA-Synthese von Hepatozyten im Vergleich zu denen von mit PBS behandelten Kontrollmäusen signifikant (3,73 % ± 0,31 % gegenüber 0,37 % ± 0,07 %, P < 0,0001) (Abb. 4f, g). Eine Wärmekarte der DEGs zwischen Fc(aMD4)B3-behandelten und PBS-behandelten Lebern zeigte, dass Fc(aMD4)B3 die Expression von mehr als 3.200 Transkripten veränderte (Abb. 4h). Unter ihnen waren deutlich angereicherte GO-Begriffe hauptsächlich an der mitotischen DNA-Replikation/Zellzyklus- und Stoffwechselprozessen beteiligt (Abb. 4i, j). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Lassotransplantation ein Met-aktivierendes Fc erzeugte, das in vivo bioaktiv ist und eine deutlich verbesserte Halbwertszeit aufweist, die mit der von unmodifiziertem Fc vergleichbar ist.

Es wurde berichtet, dass die HGF-induzierte Met-Aktivierung in präklinischen Modellen für zerebrale Ischämie, Rückenmarksverletzungen und neurologische Pathologien wie Alzheimer, amyotrophe Lateralsklerose und Multiple Sklerose vorteilhafte neuroprotektive Wirkungen ausübt35. Im Einklang mit früheren Studien haben wir bestätigt, dass Met in Neuronen im Gehirn von Mäusen exprimiert wird (ergänzende Abbildung 7). Um Met-Agonisten zu erzeugen, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren, haben wir eine Lasso-Transplantation von aMD4 auf dem Fc des Anti-Maus-TfR (mTfR)-Antikörpers49 in einer Einzel- oder Doppel-Fab-Konfiguration (sTfR(aMD4) und dTfR(aMD4)) durchgeführt. bzw.) (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 8). Die Lasso-Transplantation veränderte die zuvor berichtete 9,10-Affinität dieser Antikörper zu mTfR nicht wesentlich, was darauf hindeutet, dass die Fab-Affinität weitgehend erhalten bleibt (Abb. 5c). Im Gegensatz dazu zeigten sowohl sTfR(aMD4) als auch dTfR(aMD4) im Vergleich zu Fc(aMD4) eine verringerte Met-Aktivierung mit einer 9,6- bzw. 18,7-fachen Verringerung der EC50-Werte (20,2 ± 3,4 nM gegenüber 39,2 ± 22,3 nM gegenüber 2,1 ± 0,2 nM). ) (Abb. 5d). Dies war möglicherweise auf das Vorhandensein großer Fab-Arme auf sTfR(aMD4) und dTfR(aMD4) zurückzuführen, die möglicherweise deren Bindung und/oder Dimerisierung von Met auf der Zelloberfläche beeinträchtigt haben.

a, Schematische Darstellungen von Fc(aMD4), dTfR(aMD4) und sTfR(aMD4). Alle Varianten wurden mit aMD4ds an der B3-Schleife des menschlichen IgG-Fc gepfropft. Ratten-Anti-Maus-Transferrinrezeptor-Fab wurde mit Fc(aMD4) fusioniert. b, SDS-PAGE gereinigter Varianten. c: Die Lasso-Transplantation von aMD4 auf Anti-TfR-Antikörpern bewahrte die Affinität zu TfR. Die scheinbaren KD-Werte (in nM) von Fc(aMD4), sTfR(aMD4) und dTfR(aMD4) gegenüber Maus-TfR (mTfR) wurden durch ELISA bestimmt und werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3 unabhängige Experimente) dargestellt. d, Zelluläre Met-Aktivierung durch aMD4-gepfropfte Anti-TfR-Antikörper. EHMES-1-Zellen wurden mit Fc(aMD4), sTfR(aMD4) oder dTfR(aMD4) behandelt. Die zelluläre Met-Aktivierung wurde in situ mit dem Anti-Phospho-Met-Antikörper (Tyr1234/1235) quantifiziert und als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3 unabhängige Experimente) dargestellt. EC50-Werte (in nM) sind angegeben. e–j, BHS-Penetration von aMD4-transplantierten Anti-TfR-Antikörpern. Schema (e), Gehirnkonzentration (f), Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gehirn (g), Serumkonzentration (h) und Gehirn-Serum-Verhältnis (i) 24 Stunden nach einer einzelnen Injektion von Fc(aMD4), sTfR(aMD4) oder dTfR(aMD4) in äquimolarer Menge pro kg (12, 20 bzw. 26,5 mg kg−1) über die Schwanzvene. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4 Mäuse pro Gruppe; ungepaarter zweiseitiger t-Test) angezeigt. j, Repräsentative Bilder der immunhistochemischen Färbung von Gehirnschnitten von Mäusen 24 Stunden nach einer einzelnen Injektion von Fc(aMD4), sTfR(aMD4) oder dTfR(aMD4) über die Schwanzvene. Beachten Sie die breite Färbung von sTfR(aMD4) im Gehirnparenchym und die Lokalisierung um NeuN-positive neuronale Zellkörper. Die Färbung für dTfR(aMD4) war in Endothelzellen stärker ausgeprägt als in neuronalen Zellkörpern. Maßstabsbalken, 50 µm.

Quelldaten

Abschließend untersuchten wir die BHS-Penetration der drei aMD4-transplantierten Varianten bei Wildtyp-Mäusen nach einmaliger iv-Verabreichung in therapeutisch relevanten Dosen der Proteine ​​in äquimolarer Menge pro kg (Abb. 5e – j). Ihre Konzentrationen in mit PBS perfundierten Gehirnen oder Serum 24 Stunden nach der iv-Injektion wurden durch ELISA für menschliches IgG-Fc bestimmt. Von den drei Varianten wies sTfR(aMD4) den höchsten Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gehirn (0,96 % ± 0,07 %), das Gehirn-Serum-Verhältnis (8,3 % ± 0,7 %) sowie die höchste Gehirnkonzentration (10,7 ±) auf 1,2 nM) (Abb. 5f – i), was für die Met-Aktivierung ausreicht (Abb. 5d). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Berichten über die Ansammlung von Anti-TfR-Antikörpern mit niedriger Affinität im Gehirn9,10,50. Im Vergleich dazu waren diese Werte für dTfR (aMD4) deutlich niedriger und für Fc (aMD4) nahezu vernachlässigbar (Abb. 5f – i). In Übereinstimmung mit der durch ELISA bestimmten höheren Gehirnkonzentration zeigte sTfR(aMD4) eine deutliche parenchymale Färbung, die gleichzeitig mit NeuN, GFAP und Iba1 lokalisiert war, was auf seine Verteilung auf Neuronen, Astrozyten bzw. Mikroglia hinweist (Abb. 5j (Mitte rechts) und ergänzende Abb . 9). Im Vergleich dazu zeigte dTfR(aMD4) eine weniger ausgeprägte neuronale Färbung und eine stärkere Endothelfärbung (Abb. 5j (rechts)), was mit früheren Berichten über die Akkumulation hochaffiner Anti-TfR-Antikörper in Endothelzellen des Gehirns übereinstimmt9,10. Schließlich war Fc(aMD4) im Gehirnparenchym nicht nachweisbar (Abb. 5j (Mitte links)). Für die künftige therapeutische Bewertung von sTfR(aMD4) in präklinischen Modellen ist eine weitere Auswertung detaillierter pharmakokinetischer Profile, einschließlich des Zeitverlaufs, erforderlich. Zusammengenommen zeigten diese Beobachtungen, dass wir BHS-durchdringende Met-Agonisten durch Lasso-Transplantation von Met-bindendem makrozyklischem Peptid auf dem Fc des Anti-mTfR-Antikörpers erzeugt haben.

Das Aufpfropfen de novo identifizierter Peptide zur Verbesserung ihrer Stabilität und Bioverfügbarkeit wurde auf einer Vielzahl von Gerüsten versucht23,24,25,26. Diese früheren Studien haben gezeigt, dass eine erfolgreiche Transplantation in hohem Maße von der Kombination und Kompatibilität zwischen gepfropften Peptiden und Gerüstproteinen abhängt25,26. Daher ist die Auswahl des Gerüstproteins eine Schlüsselüberlegung, da sie den Erfolg der Peptidtransplantation bestimmt und gleichzeitig den manipulierten Produkten wünschenswerte Eigenschaften wie Stoffwechselstabilität und Zellpermeabilität verleiht24,25,26. Um diesem breiten Spektrum wünschenswerter Eigenschaften gerecht zu werden, wurden disulfidstabilisierte Peptide und Miniproteine ​​so konstruiert, dass sie als spezielle Gerüste für die Peptidtransplantation fungieren23,24,25,26. Bei diesen speziellen Gerüsten handelt es sich jedoch um kleine nichtmenschliche Proteine ​​ohne besondere eigene Bioaktivität. Obwohl natürliche menschliche Proteine ​​wünschenswerte Gerüste für die Peptidtransplantation sind, gab es bisher nur sehr begrenzte Versuche, de novo identifizierte Peptide auf natürliche menschliche Gerüste aufzupfropfen. Ein Hauptgrund dafür ist, dass das Pfropfen synthetischer, de novo identifizierter Peptide in eine unabhängig gefaltete Domäne eines natürlichen Gerüsts häufig zur Fehlfaltung und Inaktivierung beider Einheiten führen würde. Es ist daher bemerkenswert, dass unsere bisherigen Daten darauf hindeuten, dass die funktionelle Pfropfung von de novo identifizierten makrozyklischen Peptiden in die Proteinschleifen natürlicher Gerüste weitaus machbarer ist als bisher erwartet27,28,29.

Als Proteingerüst ist Fc aufgrund seiner hohen Expression, einfachen Herstellung, langen Halbwertszeit und Fab-Kompatibilität äußerst wünschenswert5,6,31,32. In dieser Studie berichten wir, dass die Lasso-Pfropfung von Fc mit makrozyklischen Peptiden Met-Rezeptor-Agonisten mit verlängerter Halbwertszeit und BHS-Penetration ergab. Unsere Anwendung der Lasso-Transplantation auf Fc hat drei wesentliche Stärken dieses Ansatzes offenbart: Erstens bewahrte die Lasso-Transplantation die gesamten biochemischen Eigenschaften von Fc in Bezug auf Expressionsniveau, FcRn-Affinität und Fab-Kompatibilität. Zweitens behielt das Lasso-gepfropfte makrozyklische Peptid die ursprüngliche makrozyklische Konformation auch ohne Disulfidbindung weitgehend bei. Drittens gibt es in Fc eine große Auswahl an geeigneten Einfügepositionen. Unsere Studie zeigte außerdem, dass die Zielaffinität gepfropfter Peptide ortsabhängig ist. Beispielsweise waren die T-Loops in unserer Studie weniger effektiv, wahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins einer N-terminalen Gelenkregion, die die Bindung der gepfropften Peptide an das Zielprotein Met stören könnte. Dennoch fungierten diese Schleifen als geeignete Pfropfpositionen für andere Rezeptorbinder27,29. Dessen ungeachtet macht die robuste Transplantatkompatibilität zwischen makrozyklischen Peptiden und Fc in Kombination mit einer großen Auswahl an Insertionspositionen das Lasso-Transplantieren zu einem besonders effektiven Ansatz des Fc-Engineerings.

Eine wichtige Schlussfolgerung unserer Ergebnisse ist, dass Lasso-Transplantation von Proteingerüsten mit spezifischen Eigenschaften als Gerüst für die Entwicklung von Designer-Rezeptoragonisten mit den gewünschten Eigenschaften basierend auf der Wahl der Proteingerüste dienen kann. Um dies zu demonstrieren, haben wir durch Lasso-Transplantation eines Anti-TfR-Antikörpers BHS-permeable Agonisten erzeugt und dabei eine etablierte BHS-Permeationstechnik genutzt8,9,10. Derzeit gibt es mehrere Versuche, Anti-TfR-Fab-Fusionsantikörper mit blockierenden Eigenschaften zu entwickeln, aber nur wenige versuchen, Agonisten-Antikörper zu entwickeln51. Lasso-Transplantation könnte verwendet werden, um zusätzlich zu antagonistischen Antikörpern auch agonistische BHS-durchdringende Antikörper zu entwickeln. Darüber hinaus besteht ein großer Nachteil aktueller BHS-durchdringender Antikörper darin, dass die systemischen Konzentrationen aufgrund ihres geringen Gehirn-Serum-Verhältnisses und ihrer langen Halbwertszeit im Blutkreislauf häufig über längere Zeiträume den gewünschten Bereich überschreiten. Dies könnte zu unerwünschter Neoimmunogenität oder Nebenwirkungen führen, insbesondere wenn das Zielmolekül in anderen Geweben funktionell wichtig ist. Mit Lasso-Grafting könnte dies vermieden werden, indem funktionelle Peptide direkt in Gerüstproteine ​​mit kurzer Halbwertszeit, wie etwa das Anti-TfR-Fab, gepfropft werden.

Im Gegensatz zu bestehenden Methoden, die die Pharmakokinetik von Proteintherapeutika durch Modifizierung des Proteins verbessern, verleiht die Lassotransplantation neuen Funktionen, die von kleinen Peptiden abgeleitet sind, auf gut verstandene Proteingerüste27,28,29 und vermeidet so potenzielle Fallstricke wie verringerte biologische Aktivität und ungünstige Proteineigenschaften zur Herstellung oder Neoimmunogenität, die durch Proteinfusion oder aus Polyethylenglykol entsteht5,6,7. Obwohl Fc aufgrund seiner immunsuppressiven Eigenschaft als hervorragendes Gerüst dient52, warten die Immunogenität, Sicherheit und Wirksamkeit von Lasso-transplantierten Proteinen auf eine zukünftige Bewertung im Rahmen der Arzneimittelentwicklung. Ebenso hat HGF in präklinischen Modellen für verschiedene Krankheiten wie nichtalkoholische Steatohepatitis53,54 oder neurologische Pathologien35,37 therapeutische Wirksamkeit gezeigt. Die therapeutischen Vorteile der in dieser Studie generierten lassotransplantierten Met-Agonisten sollten ebenfalls in Krankheitsmodellen weiter evaluiert werden.

Angesichts der rasanten Fortschritte bei wirksamen bioaktiven und transplantatkompatiblen makrozyklischen Peptiden ist die Lasso-Transplantation vielversprechend für die Entwicklung von Designer-Proteintherapeutika mit der gewünschten physikalisch-chemischen Stabilität und Pharmakokinetik sowie für die Entwicklung multifunktionaler Proteine ​​und Antikörper.

Um peptidgepfropftes Fc-Protein zu entwerfen, wurde das Fc-Protein strukturell untersucht, um einen geeigneten Insertionspunkt zu finden, bei dem der ungefähre Abstand zwischen den beiden Ankerpunktresten innerhalb einer freigelegten Schleife weniger als 7 Å betrug. Für die Konstruktion von Kontroll- oder Met-bindendem makrozyklischem Peptid (aMD4 oder aMD5) gepfropftem Fc wurde menschliches IgG1-Fc (Reste 104–330, Uni-Prot P01857) ohne Tags verwendet. Die interne Sequenz von aMD4 oder aMD5, angehängt mit oder ohne Cys und zwei Spacer-Resten von Gly an beiden Enden, wurde in diese identifizierten Stellen (T1 bis B3) eingefügt. Für die Konstruktion von Anti-Maus-TfR-Antikörpern mit aMD4ds-Insertion an der B3-Stelle wurde das Fab-Fragment eines monoklonalen Ratten-Anti-Maus-TfR-Antikörpers (Klon 8D3)49 verwendet. Das VH-zu-CH1-Fragment von 8D3 wurde an den N-Terminus von Fc(aMD4) fusioniert, um die schwere Kette (HC) von dTfR(aMD4) zu ergeben. Das VL-zu-CL-Fragment von 8D3 wurde zur Herstellung der leichten Kette (LC) verwendet. Für die Konstruktion von sTfR(aMD4) wurde am N-Terminus von Fc(aMD4) ein Flag-Tag hinzugefügt. Die für s/dTfR(aMD4) verwendeten Aminosäuresequenzen sind in der ergänzenden Abbildung 8 zu finden. Alle Expressionskonstrukte wurden unter Verwendung eines pcDNA3.1-basierten Rückgrats mit entsprechendem Signalpeptid hergestellt und die kodierende Region aller Expressionskonstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert . Proteinexpressionen wurden unter Verwendung des Expi293-Expressionssystems (Thermo Fisher) durchgeführt. Sekretierte Proteine ​​wurden auf einer HiTrap Protein A HP-Säule (Cytiva) durch Elution mit 0,1 M Citratsäure-Natriumcitrat-Puffer (pH 3,5) gereinigt, gefolgt von Neutralisierung, Dialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Größenausschlusschromatographie auf einem Superdex 200 Erhöhung 10/300GL-Säule (Cytiva), äquilibriert mit PBS. Die SDS-PAGE-Analyse und die Reinheit der im Assay verwendeten gereinigten Fc-Varianten finden Sie in der ergänzenden Abbildung 10. Für die Expression und Reinigung von sTfR(aMD4) wurden drei DNAs (TfR(aMD4) HC, TfR(aMD4) LC und Fc verwendet (aMD4)) wurden zur Co-Transfektion von Expi293F-Zellen verwendet, was die Mischung aus sTfR(aMD4), dTfR(aMD4) und Fc(aMD4) ergab. Das sTfR(aMD4) wurde aus den beiden letztgenannten Komponenten durch sequentielle Anti-Flag-Affinitätsreinigung und Größenausschlusschromatographie auf einer mit PBS äquilibrierten Superdex 200 Boost 10/300GL-Säule gereinigt.

Menschliche EHMES-1-Mesotheliomzellen wurden mit 8.000 Zellen pro Vertiefung in eine schwarze µClear-Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner Bio-One) ausgesät und in RPMI1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 24 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden mit jedem Protein in RPMI1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, für 10 Minuten oder die angegebene Zeit stimuliert, mit eiskaltem PBS gewaschen, mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 30 Minuten fixiert, mit PBS gewaschen und mit 5 % Ziegenserum blockiert 0,02 % Triton X-100 in PBS für 30 Min. Die Phosphorylierung von Met, Akt oder Erk1/2 wurde unter Verwendung eines Anti-Phospho-Met (Tyr1234/1235)-Antikörpers (1:1.000-Verdünnung, D26, Cell Signaling Technologies), phosphoryliertem Akt (S473) (1:1.000-Verdünnung, D9E, Cell Signaling Technology) oder phosphoryliertes Erk1/2 (T202/Y204) (Verdünnung 1:1.000, D13.14.4E, Cell Signaling Technology) und ein mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierter Anti-Kaninchen-Ziegen-Antikörper (Verdünnung 1:1.000, Dako). Anschließend wurde die mit ImmunoStar LD-Reagenz (Wako) entwickelte Chemilumineszenz unter Verwendung eines ARVO MX-Plattenlesegeräts (Perkin Elmer) gemessen.

Die Bindung von peptidgepfropften Fc-Proteinen an Met-Knockout-CHO-Zellen und Met-rekonstituierte CHO-Zellen27 wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die Zellen wurden durch kurze Behandlung mit 0,25 % Trypsin und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure von den Schalen abgelöst, mit 200.000 Zellen pro Vertiefung ausplattiert und mit peptidgepfropften Fc-Proteinen, verdünnt auf 10 mg ml−1 in 100 ml Ham's F-12-Medium mit 5 % FBS auf Eis für 1,5 Stunden. Nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Zellen mit Alexa Fluor 488-markiertem Ziegen-Anti-Human-IgG (1:400-Verdünnung in 100 µl Ham's F-12-Medium mit 5 % FBS, Thermo Fisher, A11013) 30 Minuten lang auf Eis inkubiert min, dann analysiert auf einem EC800-System (Sony). Das Gate bei Vorwärtsstreuung vs. Seitenstreuung wurde so eingestellt, dass es alle Zellpopulationen einschließt, jedoch ohne Ablagerungen und tote Zellen, wie in der ergänzenden Abbildung 11 gezeigt. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software (Tomy Digital Biology) analysiert.

Das Ektodomänenfragment von menschlichem Met (MetECD, 1–931) wurde C-terminal mit einer Biotin-Akzeptorsequenz (SSLRQILDSQKMEWRSNAGG) fusioniert und mit einer Biotin-Ligase (BirA) in Expi293F-Zellen coexprimiert, um eine BirA-vermittelte biosynthetische Biotinylierung zu erreichen, und darauf immobilisiert ein Biotin CAPture-Chip der Serie S (Cytiva) mit einer Oberflächendichte von ~210 Resonanzeinheiten (RU). Die Bindung von Fc und peptidgepfropften Fcs wurde durch Injektion der Analytlösungen seriell verdünnt unter Verwendung des Laufpuffers (20 mM HEPES-NaOH (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20) bewertet. Die Läufe wurden im Einzelzyklus-Kinetikmodus unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: Flussrate von 30 µl/min, Kontaktzeit von 120 s und Dissoziationszeit von 300 s. Nach jedem Lauf wurde die Oberfläche durch Injektion des Regenerationspuffers (6 M Guanidin-HCl, 250 mM NaOH) regeneriert, bis die Reaktion auf das ursprüngliche Ausgangsniveau zurückkehrte. Die Bindungskurven wurden durch Subtraktion des RU der Referenzzelle (nicht immobilisiert) von dem der Messzelle (immobilisiert mit MetECD) erhalten und zur Ableitung kinetischer Bindungswerte verwendet. Die Daten wurden mit einem Biacore T200-Instrument (Cytiva) bei 25 °C erfasst und die Ergebnisse mit der Biacore T200-Auswertungssoftware v3.2 (Cytiva) analysiert. Biotinyliertes menschliches FcRn/β2M (ACROBiosystems) wurde auf der Oberfläche von mit Streptavidin beschichteten Chips (Cytiva) bei 180–220 RU eingefangen. Die Analyten wurden in Laufpuffer (50 mM Phosphat (pH 6,0), 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 20) verdünnt und 1 Minute lang mit 30 µl min-1 injiziert, gefolgt von einer 0,7-minütigen Dissoziation. Die Bindungskurven wurden durch Subtrahieren des RU der Referenzzelle (nicht immobilisiert) von dem der Messzelle (immobilisiert mit FcRn/2M) erhalten und nach Achsennullung wurden die Sensorgramme lokal an ein 1:1 Langmuir-Bindungsmodell angepasst. Die Daten wurden mit einem Biacore 3000-Instrument (Cytiva) bei 25 °C erfasst und die Ergebnisse mit der BIAevaluation-Software v4.1 (Cytiva) analysiert.

Strukturen der CH3-Domäne von Fc mit in die B1- oder B3-Schleife eingefügtem aMD4 oder aMD5 wurden mithilfe von ColabFold und AlphaFold2 in MMseqs255 vorhergesagt.

Der Trypsinverdau und die LC-MS/MS-Analyse wurden von KANEKA TECHNO RESEARCH durchgeführt. Einhundert µg Fc(aMD4ds)T1 oder Fc(aMD4ds)B3 in PBS wurden mit 100 mM Ammoniumbicarbonat (Sigma-Aldrich) behandelt, das 8 M Harnstoff (Fujifilm Wako Pure Chemicals) enthielt. Nach der Entsalzung mit einem Amicon Ultra-Gerät (MWCO: 10 K, Millipore) wurden 10 µg jedes Proteins 12 Stunden lang bei 37 °C unter nicht reduzierenden Bedingungen mit Trypsin (Promega) verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ameisensäure gestoppt. Die Proben wurden in ein Nexera X2 UHPLC-System (Shimadzu Corporation) injiziert, das an ein SCIEX TripleTOF 6600-System (AB SCIEX) angeschlossen war, das mit einer ESI-Ionisationsquelle ausgestattet war. Die Peptide wurden chromatographisch auf einer C18-Umkehrphasensäule mit linearem Gradienten der mobilen Phase A (Wasser mit 0,1 % Ameisensäure) und der mobilen Phase B (Acetonitril (Fujifilm Wako Pure Chemicals) mit 0,1 % Ameisensäure) getrennt. MS- und MS/MS-Daten wurden im IDA-Positivionenmodus erfasst. Die LC-MS-Rohdaten wurden mit der SCIEX BioPharmaView-Software verarbeitet. Die folgenden Kriterien wurden zur Identifizierung von Peptiden verwendet: Die Massengenauigkeit für den passenden Vorläufer muss innerhalb von 5 ppm des Massenfehlers liegen, und der Peptid-Matching-Score wurde zur Peptididentifizierung auf mindestens 3 festgelegt.

MetECD (60 nM) und Fc(aMD4)B1/B2/B3 (20 nM) wurden 1 Stunde lang in 100 µl PBS mit 0,01 % Triton X-100 gemischt. Die Proben wurden in zwei Teile geteilt und mit 1 mM BS3 (Thermo Fisher) behandelt oder 1 Stunde lang unbehandelt gelassen, mit 50 mM Tris gequencht, einer SDS-PAGE (7,5 % oder 3–10 % Gel) unterzogen und mit Silber gefärbt. Für die HS-AFM-Beobachtung wurden MetECD (2,6 µM) und Fc(aMD4)B3 (1,3 µM) 1 Stunde lang in 100 µl PBS mit 0,01 % Triton X-100 gemischt, 1 Stunde lang mit 1 mM BS3 behandelt und durch gequencht 50 mM Tris und analysiert durch Größenausschlusschromatographie auf einer mit PBS äquilibrierten Superose 6-Erhöhungs-10/300GL-Säule (Cytiva). Die getrennten Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Eine einzelne Fraktion wurde einer HS-AFM-Analyse unterzogen.

HS-AFM-Messungen wurden im Tapping-Modus durchgeführt. Die Auslenkung des Auslegers wurde mit einem optischen Strahlablenkungsdetektor unter Verwendung eines Infrarotlasers (IR) (0,7 mW, 780 nm) erfasst. Der IR-Laserstrahl wurde durch eine x60-Objektivlinse (CFI S Plan Fluor ELWD x60; Nikon) auf die Rückseite eines mit Goldfilm bedeckten Auslegers (Olympus, BL-AC10DS-A2) fokussiert. Die Reflexion des IR-Lasers vom Ausleger wurde mithilfe einer zweisegmentigen PIN-Fotodiode (MPR-1; Graviton) erfasst. Die freie Schwingungsamplitude betrug ungefähr 1 nm und die Sollamplitude betrug ungefähr 90 % der freien Amplitude für die Rückkopplungssteuerung von HS-AFM. Für die AFM-Sonde wurde eine durch Elektronenstrahlabscheidung gewachsene amorphe Kohlenstoffspitze mit einer Länge von ca. 500 nm verwendet. Für das AFM-Substrat wurde eine mit 0,01 % 3-Aminopropyltriethoxysilan (Shin-Etsu Silicone) behandelte Glimmeroberfläche verwendet. Alle HS-AFM-Beobachtungen wurden in einer Pufferlösung mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 100 mM NaCl bei Raumtemperatur durchgeführt.

Monoschichten primärer menschlicher Hepatozyten, die von chimären Mäusen mit humanisierter Leber stammten, wurden von PhoenixBio erhalten und in kollagenbeschichteten Platten mit 12 Vertiefungen gezüchtet. Hepatozyten wurden in dHCGM-Medium kultiviert, das aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % FBS, 20 mM HEPES, 44 mM NaHCO3, Antibiotika (100 U ml–1 Penicillin G und 100 µg ml–1 Streptomycin), 15 µg ml– bestand 1 l-Prolin, 0,25 µg ml-1 Insulin, 50 nM Dexamethason, 5 ng ml-1 epidermaler Wachstumsfaktor, 0,1 mM l-Ascorbinsäure und 2 % Dimethylsulfoxid (alle Nahrungsergänzungsmittel von PhoenixBio).

Kryokonservierte menschliche Hepatozyten wurden von Gibco bezogen. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit extrem geringer Bindung (Nunclon Sphera, Thermo Fisher) mit 1.500 lebensfähigen Zellen pro Well ausgesät und anschließend 2 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert. Die Zellen wurden in 100 µl Williams E-Medium, ergänzt mit 2 mM GlutaMAX, 100 U ml-1 Penicillin, 100 µg ml-1 Streptomycin, 4 µg ml-1 Insulin, 1 µM Dexamethason, 15 mM HEPES (pH 7,4) und 10 % FBS (alle Ergänzungen von Oriental Yeast). Ab fünf Tagen nach der Aussaat, als die Sphäroide ausreichend kompakt waren, wurden alle 2 Tage 50 % des Mediums durch serumfreies Williams-E-Medium, ergänzt mit 2 mM GlutaMAX, 100 U ml-1 Penicillin, 100 µg ml-1 Streptomycin, ausgetauscht. 6,25 µg ml-1 Insulin, 6,25 µg ml-1 Transferrin, 6,25 µg ml-1 selenige Säure, 1,25 mg ml-1 BSA, 5,35 µg ml-1 Linolsäure, 100 nM Dexamethason und 15 mM HEPES (pH 7,4) (alle Nahrungsergänzungsmittel aus orientalischer Hefe). Die Sphäroide wurden in einem serumfreien Medium mit 0,3 nM HGF oder 30 nM Fc(aMD4)B3 an den Tagen 7 und 9 behandelt. Für jede Gruppe wurden 48 Sphäroide gesammelt und an den Tagen 8 oder 10 einer RNA-Isolierung unterzogen.

Monoschichtige Hepatozyten wurden in DMEM mit 0,2 % BSA 3 Stunden lang serumentzogen, mit HGF (0,01–1 nM), Fc(aMD4)B3 (1–100 nM), Fc (100 nM) oder unstimuliert (keine) in DMEM stimuliert 10 % Serum für 10 Min. EHMES-1-Zellen wurden 3 Stunden lang in RPMI1640 mit 0,2 % BSA serumentzogen, mit HGF (0,04–1,1 nM), Fc(aMD4)B3 (1,3–33 nM) stimuliert oder 10 Minuten lang in RPMI1640 mit 0,2 % BSA unstimuliert. Diese Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und in 400 µl Lysepuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % NP-40, 10 % Glycerin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1) lysiert mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure und Proteaseinhibitoren). Die Lysate wurden durch eine 27G-Nadel und einen 0,45-µm-Filter geleitet und zentrifugiert. Die Proteinkonzentrationen der Lysate wurden mittels Bicinchoninsäure-Assay (Thermo Fisher) gemessen. Die Überstände wurden einem Western Blot auf phosphoryliertes Erk1/2 (T202/Y204) (1:1.000-Verdünnung, D13.14.4E, Cell Signaling Technology), Erk1/2 (1:1.000-Verdünnung, 137F5, Cell Signaling Technology) und phosphoryliert unterzogen Akt (S473) (1:1.000-Verdünnung, D9E, Cell Signaling Technology), Akt (1:1.000-Verdünnung, 11E7, Cell Signaling Technology) oder GAPDH (1:1.000-Verdünnung, 14C10, Cell Signaling Technology). Die Überstände wurden einer Immunpräzipitation mit einem Anti-Met-Antikörper (5 µg für 600 µl Lysate, D-4, Santa Cruz Biotechnology) und einem Western-Blot für Met (1:1.000-Verdünnung, D1C2, Cell Signaling Technology) und phosphoryliertes Met (Y1234) unterzogen /Y1235) (1:1.000-Verdünnung, D26, Cell Signaling Technology), phosphoryliertes Met (Y1003) (1:1.000-Verdünnung, 13D11, Cell Signaling Technology) oder phosphoryliertes Met (Y1349) (1:1.000-Verdünnung, 130H2, Cell Signaling Technology). ). Den Blottings folgten HRP-konjugierte Sekundärantikörper (Dako) und die Messung der mit ImmunoStar LD-Reagenz (Wako) entwickelten Chemilumineszenz unter Verwendung des Bildlesegeräts FUSION-SOLO.6S.EDGE (VIRVER). Für das Phospho-RTK-Array wurden Hepatozyten 3 Stunden lang in DMEM mit 0,2 % BSA an Serum gehungert und mit HGF (1 nM), Fc(aMD4)B3 (100 nM), Fc (100 nM), verdünnt in DMEM mit 10 % BSA, stimuliert. Serum für 10 Minuten, mit eiskaltem PBS gewaschen, in 400 µl Lysepuffer 17 (R&D Systems) mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Nacalai Tesque) lysiert, durch einen 0,45 µm-Filter geleitet und zentrifugiert. Die Lysate (1 mg) wurden mit dem Human Phospho-RTK Array Kit (R&D Systems) analysiert.

Die Gesamt-RNA von Hepatozyten-Sphäroiden oder mit RNAlater (Thermo Fisher) behandelten Lebern von PXB-Mäusen wurde unter Verwendung des QIAzol-Lysereagenz (Qiagen) hergestellt und zur RNA-Qualitätskontrolle und RNA-Seq auf einem DNBSEQ an das Bioengineering Lab (Kanagawa, Japan) geschickt -G400-Sequenzer (MGI Tech). Komplementäre DNA-Bibliotheken für RNA-seq wurden mit dem MGIEasy RNA Directional Library Prep Set (MGI Tech) erstellt und mit dem AATI-Fragmentanalysator (Advanced Analytical Technologies) ausgewertet. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit dem MGIEasy-Zirkularisierungskit (MGI Tech) zirkularisiert, mit dem Hochdurchsatz-Sequenzierungskit DNBSEQ-G400RS (MGI Tech) als DNA-Nanokugeln hergestellt und anschließend massiv parallel sequenziert (2 × 100 bp) auf einem DNBSEQ-G400 Sequenzer (MGI Tech). Nach dem Ausschluss von Adaptersequenzen mithilfe von Cutadapt (Version 1.9.1) und von Sequenzen mit einem niedrigen Qualitätsscore (<20) oder weniger als 40 Nukleotiden mithilfe von Sichel (Version 1.33) wurden die Lesevorgänge mit dem menschlichen Referenzgenom (GRCh38.p13) abgeglichen die Hisat2-Software (v2.2.0). Die Ausrichtungsdaten wurden mit featureCounts (Version 2.0.0) gezählt. Die Transkripthäufigkeit wurde in Lesevorgängen pro Kilobase Exon pro Million kartierter Lesevorgänge (RPKM) und Transkripten pro Million (TPM) gemessen. Die DEG-Analyse wurde mit DEGES in TCC (v1.18.0) und DESeq (v1.30.0) durchgeführt (FDR < 0,05 oder < 0,01, Benjamini-Hochberg, zweiseitig). Alle identifizierten DEGs wurden einer Clusteranalyse mit Gene Cluster 3.0 unterzogen. Signifikant angereicherte GO-Begriffe wurden mithilfe der GO Enrichment Analysis von PANTHER identifiziert.

Die Halbwertszeit im Serum von bis zu 9 Stunden wurde bei Wildtyp-C57BL/6-Mäusen (weiblich, 9 Wochen, 18–21 g, erhalten von Japan SLC) bestimmt, denen eine einzelne Schwanzveneninjektion von 0,7 mg kg−1 für Fc verabreicht wurde , 0,74 mg kg−1 für Fc(aMD4)B3 und 1,0 mg kg−1 für humanes rekombinantes HGF (Kringle Pharma), verdünnt in 100 µl PBS. Die Halbwertszeit im Serum bis zu 12 Tagen wurde in heterozygoten mFcRn−/− hFcRn Tg 276-Mäusen (weiblich, 9–12 Wochen, 18–24 g) bestimmt, die durch Paarung von mFcRn−/− Mäusen und hFcRn Tg 276-Homozygoten selbst hergestellt wurden Mäuse, erhalten vom Jackson Laboratory. Mäuse erhielten eine einzelne Schwanzveneninjektion mit 0,7 mg kg−1 für Fc oder 0,74 mg kg−1 für Fc(aMD4)B3, verdünnt in 100 µl PBS. Die Halbwertszeit im Serum bis zu 12 Tagen wurde auch bei chimären Mäusen mit humanisierter Leber (PXB-Mäuse, PhoenixBio, männlich, >12 Wochen, 19–24 g) bestimmt, denen eine einzelne Schwanzveneninjektion oder eine subkutane Injektion von 5,0 mg kg verabreicht wurde −1 für Fc(aMD4)B3, verdünnt in 100 µl PBS. Zu jedem Zeitpunkt wurde Blut aus der Vena submandibularis mit einer Goldrute-Tierlanzette (Bio Research Center) oder aus dem Plexus orbitalis entnommen, zu Serum verarbeitet und bis zur Analyse bei –80 ° C gelagert. Die Serumkonzentrationen von Fc und Fc(aMD4)B3 wurden mithilfe eines Immunoassays zur Erkennung menschlicher Immunglobuline (Human IgG ELISA Quantitation Set, Bethyl Laboratories) bestimmt. Die Serumkonzentrationen von HGF wurden mithilfe eines selbst entwickelten ELISA bestimmt. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Ordnungsgemäßen Durchführung von Tierversuchen (1. Juni 2006, Science Council of Japan) durchgeführt. Die Verfahren wurden vom Institutional Review Board der Kanazawa University oder dem Laboratory Animal Ethics Committee von PhoenixBio genehmigt.

Chimäre Mäuse mit humanisierten Lebern (PXB-Mäuse, PhoenixBio) wurden aus Mäusen mit Plasminogenaktivator-cDNA vom Urokinase-Typ und Mäusen mit schwerer kombinierter Immunschwäche erzeugt, denen menschliche Hepatozyten transplantiert wurden, wobei etwa 80 % der Hepatozyten humanisiert waren48. PXB-Mäusen (männlich, >12 Wochen, 15–21 g) wurde eine einzelne subkutane Injektion von 5 mg kg−1 für Fc(aMD4)B3 in 200 µl PBS oder Kontroll-PBS verabreicht. Vierundvierzig Stunden nach der Verabreichung von Fc(aMD4)B3 oder Kontroll-PBS wurde chimären Mäusen 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) (Sigma Chemical) 2 Stunden lang intraperitoneal in einer Dosis von 100 mg kg−1 injiziert Tötung. Aus PXB-Mäusen isolierte Lebern wurden mit RNAlater für die RNA-Seq behandelt oder für die BrdU-Färbung vorbereitet. Formalinfixierte Paraffinschnitte chimärer Lebern wurden mit einem Ratten-Anti-BrdU-Antikörper bei 3 µg ml–1 (Abcam, ab6326) inkubiert, gefolgt von einem Alexa Fluor 488-konjugierten anti-Ratten-IgG-Ziegen-polyklonalen Antikörper bei 1 µg ml–1 (Abcam, ab150157). Die Kerne wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Thermo Fisher) bei 300 nM gegengefärbt. Fluoreszenzbilder wurden mit Keyence BZ-X810 aufgenommen. Die Anzahl der BrdU-positiven Kerne wurde durch Zählen von mindestens 15.000 Zellen in 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern in Schnitten aus dem lateralen linken Lappen und dem medialen rechten Lappen pro Tier bestimmt. Die Verfahren mit humanisiertem Lebergewebe wurden von der Ethikkommission für die Nutzung menschlichen Gewebes von PhoenixBio genehmigt. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Ordnungsgemäßen Durchführung von Tierversuchen (1. Juni 2006, Science Council of Japan) durchgeführt. Die Verfahren wurden von der Ethikkommission für Labortiere von PhoenixBio genehmigt.

MaxiSorp-Platten (Nunc) wurden über Nacht bei 4 °C mit rekombinantem Maus-TfR (2 µg ml−1 in PBS, 50 µl pro Vertiefung, R&D Systems) beschichtet, mit 0,05 % Tween 20 in PBS gewaschen und mit 1 % BSA in PBS blockiert . Die Platten wurden mit 1:3-Serientitrationen von dTfR(aMD4), sTfR(aMD4) oder Fc(aMD4), verdünnt mit 0,05 % Tween 20 und 1 % BSA in PBS, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und mit 0,05 % Tween 20 gewaschen PBS, inkubiert mit HRP-konjugiertem Anti-Human-IgG-Fc-Antikörper (0,5 µg ml−1, 100 µl pro Vertiefung, Bethyl Laboratories) bei Raumtemperatur für 1 Stunde und gewaschen mit 0,05 % Tween 20 in PBS. Signale wurden durch Inkubation mit 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Substrat (Cell Signaling Technology) erzeugt und die Absorption wurde mit einem ARVO MX-Plattenlesegerät (Perkin Elmer) abgelesen.

Wildtyp-C57BL/6-Mäusen (weiblich, 7–8 Wochen, 17–20 g, erhalten von SLC) wurde eine einzelne Schwanzveneninjektion in einer äquimolaren Menge pro kg verabreicht: 26,5 mg kg−1 für dTfR(aMD4), 20,0 mg kg−1 für sTfR(aMD4) oder 12,0 mg kg−1 für Fc(aMD4), verdünnt in 200 µl PBS. 24 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse betäubt und Blut aus der rechten Herzkammer entnommen und zu Serum verarbeitet. Nach 8-minütiger Perfusion mit PBS mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min wurden Gehirne von Mäusen isoliert. Jede Gehirnhälfte wurde in 1 % NP-40 (Calbiochem) in PBS, das CompleteMini EDTA-freie Proteaseinhibitor-Cocktailtabletten (Roche Diagnostics) enthielt, homogenisiert, 1 Stunde lang bei 4 °C rotiert, 20 Minuten lang bei 14.000 U/min geschleudert und Überstände gesammelt. Das Serum und die Gehirnlysate wurden einer Antikörpermessung unter Verwendung eines Immunoassays zur Erkennung menschlicher Immunglobuline (humanes IgG-ELISA-Quantifizierungsset, Bethyl Laboratories) unterzogen. Um die Konzentrationen im Gehirn zu berechnen, wurde ng g−1 Gehirn als ng ml−1 angenommen. Jede Gehirnhälfte wurde in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (Sakura Finetek Japan) eingebettet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit einer Dicke von 10 µm geschnitten. Nach 30-minütiger Fixierung in 4 % Paraformaldehyd in PBS wurden die Schnitte in 5 % BSA, 0,3 % Triton ein Maus-Anti-Maus-NeuN-Antikörper (1:500-Verdünnung, Millipore), ein Maus-Anti-GFAP-Antikörper (1:500-Verdünnung, GA5, Cell Signaling Technologies) oder ein Maus-Anti-Iba1-Antikörper (1:500-Verdünnung, GT10312, GeneTex). ) in 1 % BSA und 0,1 % Triton X-100 in PBS bei 4 °C über Nacht. Anti-Human-IgG-Fc und Anti-NeuN wurden mit einem Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Ziegen-Sekundärantikörper bzw. einem Alexa Fluor 594-konjugierten Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:200-Verdünnung, Thermo Fisher) sichtbar gemacht. Fluoreszenzbilder kortikaler Regionen wurden mit dem Keyence BZ-X810 aufgenommen. Diese Studie wurde vom Institutional Review Board der Universität Kanazawa genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Für die grafische Darstellung und statistische Analyse wurde Graphpad Prism 6.0d verwendet. Relevante statistische Methoden für einzelne Experimente sind in den Abbildungslegenden aufgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Die RNA-seq-Daten sind im DDBJ Sequence Read Archive unter den Zugangsnummern DRA014557 (Hepatozyten-Sphäroide) und DRA014558 (Lebern von PXB-Mäusen) verfügbar. Die im Rahmen der Studie generierten Rohdaten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Quelldaten für die Zahlen sind diesem Dokument beigefügt.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von: World Premier International Research Center Initiative (WPI), MEXT, Japan; ein Zuschuss für JSPS Scientific Research (C) (20K06553) an KS; ein Zuschuss für JSPS Scientific Research (B) (19H03499) und anspruchsvolle Forschung (21K18250) an KM; Programm für Grundlagen- und klinische Forschung zu Hepatitis von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21fk0210087) an KS; AMED-Plattformprojekt zur Unterstützung der Arzneimittelentdeckung und biowissenschaftlichen Forschung (Grundlage zur Unterstützung innovativer Arzneimittelentdeckung und biowissenschaftlicher Forschung) an HS (JP19am0101090) und JT (JP19am0101075); und ein Zuschuss für JSPS Scientific Research (B) (21H01771) an MS. Diese Arbeit wurde im Rahmen des kooperativen Forschungsprogramms des Instituts für Proteinforschung der Universität Osaka (CR15-05) und eines außeruniversitären kooperativen Forschungsstipendiums von durchgeführt das Krebsforschungsinstitut (Universität Kanazawa). Wir danken Dolphin Co. Ltd für die englischsprachige Rezension.

Abteilung für Tumordynamik und -regulation, Krebsforschungsinstitut, Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan

Katsuya Sakai, Nichole Marcela Rojas-Chaverra, Hiroki Sato, Ryu Imamura, Itsuki Sakai und Kunio Matsumoto

WPI-Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI), Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan

Katsuya Sakai, Ryu Imamura, Mikihiro Shibata und Kunio Matsumoto

Labor für Proteinsynthese und -expression, Institut für Proteinforschung, Universität Osaka, Suita, Japan

Nozomi Sugano-Nakamura, Emiko Mihara, Sayako Watanabe und Junichi Takagi

Forschungseinheit für Tumormikroumgebung, Institute for Frontier Science Initiative, Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan

Hiroki Sato und Kunio Matsumoto

Abteilung für Entzündung und epitheliale Plastizität, Krebsforschungsinstitut, Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan

Dominic Chih-Cheng Voon

Innovative Einheit für Krebsmodellforschung, Institute for Frontier Science Initiative, Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan

Dominic Chih-Cheng Voon

Forschungs- und Entwicklungsabteilung, PhoenixBio Co. Ltd, Higashihiroshima, Japan

Chihiro Yamasaki & Chise Tateno

Abteilung für Hochgeschwindigkeits-AFM für biologische Anwendungen, Institute for Frontier Science Initiative, Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan

Mikihiro Shibata

Fachbereich Chemie, Graduate School of Science, Universität Tokio, Tokio, Japan

Hiroaki Suga

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KS, H. Suga, JT und KM konzipierten und gestalteten die Studie. KS führte Expression und Reinigung von Proteinen, zelluläre Tests, SPR für FcRn, Crosslink, RNA-seq, Serumhalbwertszeitexperimente und mTfR-Bindungstests durch. NS-N. führte Durchflusszytometrie und SPR für Met durch. EM führte eine vorläufige Bewertung der Fc-Transplantate und ihrer Aktivitäten durch. SW führte die Proteinexpression und -reinigung sowie die Kartierung der Bindungsstelle über die chimären Met-Experimente durch. NMR-C. führten BBB-Penetrationsexperimente durch. IS führte DS-Varianten durch. H. Sato führte Immunhistochemie durch und beteiligte sich an Tierversuchen. RI beteiligte sich an Tierversuchen. DC-CV beteiligte sich an Tierversuchen und überarbeitete das Manuskript kritisch. CY und CT führten eine BrdU-Markierung bei PXB-Mäusen durch. MS führte HS-AFM durch. Das Manuskript wurde von KS verfasst. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Katsuya Sakai, Junichi Takagi oder Kunio Matsumoto.

H. Suga und JT sind Mitbegründer und Anteilseigner von MiraBiologics Inc. EM, KS und KM sind ebenfalls Anteilseigner desselben Unternehmens. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt Richard Siegel, Birgit Schoeberl, Manuel Sanchez-Felix und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Konditioniertes Medium der Expi293F-Suspensionskultur, das Kontroll-Fc oder Fc-Varianten exprimiert, wurde mit Protein-A-Kügelchen abgezogen und durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt. Das Bild für Fc(aMD4) wurde aus unserem vorherigen Bericht27 reproduziert.

Bindungssensorgramme von Fc oder Fc(aMD4) an menschliches MetECD, bestimmt durch Oberflächenplasmonresonanz. Gemessene Kurven werden rot dargestellt. Angepasste Kurven werden in Schwarz angezeigt. RU, Resonanzeinheiten; SPR, Oberflächenplasmonresonanz.

a, Phosphorylierungsniveaus von Met-Tyrosinresten in EHMES-1-Zellen, die 10 Minuten lang mit HGF oder Fc(aMD4)B3 behandelt wurden. Die Lysate wurden mittels Western Blot analysiert. bc, EHMES-1-Zellen wurden mit HGF (b) oder Fc(aMD4)B3 (c) behandelt. Die Aktivierung von Met, Akt oder Erk1/2 zu jedem Zeitpunkt nach der Stimulation wurde in situ mit antiphosphoryliertem Met (Tyr1234/1235), antiphosphoryliertem Akt (S473) oder antiphosphoryliertem Erk1/2 (T202/Y204) quantifiziert ) Antikörper bzw. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM der Faltungsinduktion im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen (n = 4, unabhängige Experimente) angezeigt.

Quelldaten

a: Die Assoziation zwischen Fc(aMD4)B3 und menschlichem MetECD, Maus-MetECD oder chimärem MetECD, das Mensch und Maus unterschiedlich fusionierte, wurde durch einen Pull-Down-Assay bewertet. PA-markiertes MetECD wurde unter Verwendung von mit Anti-PA-Tag-Antikörpern konjugierten Perlen präzipitiert. In Übereinstimmung mit unserem vorherigen Bericht, dass das aMD4-Peptid an menschliches, aber nicht an Maus-MetECD40 bindet, band Fc(aMD4)B3 an menschliches MetECD (hWT), aber nicht an Maus-MetECD (mWT). Der Ersatz der PSI-Domäne und der IPT-Domänen durch die Maussequenz (Varianten A–E) bewahrte die Bindung an Fc(aMD4)B3, was darauf hindeutet, dass die PSI-Domäne und die IPT-Domänen für die Fc(aMD4)B3-Bindung entbehrlich waren. Im Gegensatz dazu waren für die Bindung von Fc(aMD4)B3 humanspezifische Reste in den Blättern 5–7 der Sema-Domäne erforderlich (Variante F). Die Zahlen in der Sema-Domäne geben die einzelnen Blades an. b, Humanspezifische Reste in Blatt 6 (B6-1 und B6-2 in d) waren für die Fc(aMD4)B3-Bindung unverzichtbar. c, Humanspezifische Reste in Blatt 5 (B5-1 und B5-2 in d) waren ebenfalls unverzichtbar bzw. trugen zur Fc(aMD4)B3-Bindung bei. d, Aminosäuresequenz-Alignment von Met-Sema-Domänen von Mensch und Maus. Rückstände, die zwischen Mensch und Maus unterschiedlich sind, sind fett markiert. Die roten Balken (B5-1, B6-1 und B6-2) zeigen die für die Fc(aMD4)B3-Bindung unverzichtbaren Reste an. Der orangefarbene Balken (B5-2) zeigt die Reste an, die zur Fc(aMD4)B3-Bindung beitragen.

a: Das mittels SDS-PAGE analysierte Molekulargewicht zeigte einen 2:1- und 1:1-Komplex von MetECD und Fc(aMD4)B3 an. Die SDS-PAGE-Analyse wurde unter Verwendung von 7,5 % Gelen (blau, aus Abb. 3b) und 3–10 % Gelen (orange, aus b) durchgeführt. b, SDS-PAGE-Analyse der Met-Dimerbildung durch Fc(aMD4) in vitro. Die Komplexe zwischen MetECD und Fc(aMD4) oder Kontroll-Fc wurden durch BS3 vernetzt und durch SDS-PAGE (3–10 % Gel) unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert und mit Silber gefärbt. c, MetECD und Fc(aMD4)B3 wurden durch BS3 vernetzt und einer Größenausschlusschromatographie (SEC) unterzogen. Dargestellt sind die Ergebnisse der nichtreduzierenden SDS-PAGE der SEC-Fraktionen mit Coomassie-Brilliantblau-Färbung. Die rot angezeigte Fraktion wurde einer HS-AFM unterzogen, wie in Abb. 3e, f gezeigt.

Quelldaten

a, Bindungssensorgramme von Fc an FcRn/β2 M bei pH 6,0 und 7,4. Ass, Zusatz von Fc; Diss, Pufferwäsche. b, Bindungssensorgramme von Fc oder Fc(aMD4) an FcRn/β2 M bei pH 6,0. Sensorgramme zeigen Duplikate von drei Analytkonzentrationen (250, 500, 1.000 nM). RU, Resonanzeinheiten; SPR, Oberflächenplasmonresonanz.

Ergänzende Abbildungen.

HS-AFM-Analyse von Fc(aMD4)B3.

HS-AFM-Analyse von MetECD.

HS-AFM-Analyse eines 2:1-Komplexes aus MetECD und Fc(aMD4)B3 mit weggesprühten IPT-Stieldomänen.

HS-AFM-Analyse eines 2:1-Komplexes aus MetECD und Fc(aMD4)B3 mit angehängten IPT-Stieldomänen.

Quelldaten für die ergänzende Abbildung 3.

Quelldaten für die ergänzende Abbildung 6.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sakai, K., Sugano-Nakamura, N., Mihara, E. et al. Entwicklung von Rezeptoragonisten mit verbesserter Pharmakokinetik durch Pfropfung makrozyklischer Peptide in fragmentkristallisierbare Regionen. Nat. Biomed. Eng 7, 164–176 (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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Eingegangen: 22. Oktober 2021

Angenommen: 26. September 2022

Veröffentlicht: 07. November 2022

Ausgabedatum: Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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Naturbiomedizinische Technik (2022)